Frontiers in Materials

細胞外マトリックス

細胞外マトリックスタンパク質と細胞の相互作用は細胞骨格構成、細胞成長、細胞移動、組織発生に重要な役割を果たす（Zhong et al, 1998; Sternlicht and Werb, 2001; Stevens and George, 2005)。 ECMは、細胞の微小環境を構成する分泌分子を含んでいる。 ECMの主な構成要素は、グリコサミノグリカン（GAG）とエラスチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの繊維状タンパク質の親水性拡張ゲルのネットワークであり、これらは分子間および分子内の特定の結合ドメインを通して結合している。 ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸などのGAGは、ECMタンパク質と結合してプロテオグリカンを形成する高膨潤の糖鎖ポリマーである。 GAGは浸透圧によって水を保持し、成長因子、ECM、細胞の水和と活性を維持することができる。 GAG分子は、血管新生、発生過程、腫瘍転移、血液凝固など、幅広い生物学的活動を制御することができる（Kim et al.） 例えば、コラーゲンはECMの中で最も豊富なタンパク質であり、骨基質タンパク質量の90％を構成している。 コラーゲンは、繊維状タンパク質としてECMに存在し、細胞を収容するための構造的な足場を提供する。 構造的には、コラーゲンは3つの左巻きらせんからなるプロコラーゲンから組み立てられています。 繊維状のプロコラーゲンは、直径約1.5 nm、長さ300 nmの伸びた超らせん構造を形成するように配置されている。 プロコラーゲンは、生体内および試験管内で自発的に、長さ数ミクロン、幅10〜500 nm、周期67 nmのフィブリルに自己集合することが可能である。 コラーゲンの凝集状態や空間分布は、細胞の発生や、インテグリンの認識によるシグナル伝達を調節することが分かっている（Hui et al. したがって、ECMネットワークの基底構造の組織化および細胞挙動の制御において、コラーゲン上のフィブロネクチンの付着は特に重要である（roekelmann et al, 1991; Dalton et al, 1995）。 例えば、創傷治癒においては、線維芽細胞は平滑筋アクチン、プロコラーゲンおよびフィブロネクチンを高レベルで発現している。 フィブロネクチンは、コラーゲンへの細胞接着のメディエーターであることが示されている。 このように、細胞のECMへの接着は、その後の分化や増殖の行動に重要である（Ingber, 2003）。 In vitro環境では、細胞は培養表面に播種され、すぐにフィブロネクチンなどの適切なECMタンパク質を分泌して、より良い広がりと接着のために表面を改質することにより、環境に適応することができる。 ECMの分子間相互作用は、細胞の活動に応じてダイナミックに変化する。 この複雑なプロセスは、培養液、吸着タンパク質、基質、細胞の種類などの培養環境と関連している。 コラーゲン堆積表面での細胞の接着や増殖には、十分な量のフィブロネクチンが必要であることが分かっている（Grinnell and Minter, 1978; Dewez et al., 1999）。 さらに、下層の基質の表面特性がタンパク質の接着を支配し、沈着したタンパク質の様々な表面内容、コンフォメーション、および濃度をもたらす。 ガラスや組織培養用ポリスチレンなどの伝統的な培養システムでは、非特異的なタンパク質吸着を促進するため、細胞とECM内の対応する成分/タンパク質との間の相互作用を確実に調査できないことに留意すべきである

ほとんどの哺乳類細胞は、ECMタンパク質が沈着した表面に付着するとin vitroで成長するだけである。 ECMは構造的・機械的な支持にとどまらず、幹細胞ニッチ、発生パタンニング、がんの進行に関与している。 ECMの物理的特性は、シグナル伝達プロセスにおいて重要な役割を果たすと考えられる。 ECM構造は伸縮自在で柔軟性があり、様々な機械的張力が暗号部位にかかり、その受容体や成長因子とさらに反応する可能性がある。 機械的特性に関しては、ECMはその構成、濃度、架橋構造により、硬い骨組織から柔らかい脳まで、様々な程度の弾性と剛性を持つことが可能である。 ECMの弾性は数桁にも及び、細胞収縮、細胞増殖、移動、分化、細胞死など、多くの細胞機能の制御に重要な役割を果たすことが示されている（Discherら、2005年、Englerら、2006年）。 また、ECMタンパク質のナノ構造が、細胞の活性にかなりの影響を与えることが分かっている（Koyama et al., 1996; Jones et al., 1997; Huang et al., 2010a）。 自然界に存在するI型コラーゲンは、自発的にらせん構造を形成している。 熱や酸の処理により、コラーゲンの規則正しい三次元構造は破壊される（変性コラーゲンまたはゼラチン）。 驚くべきことに、変性コラーゲンは、野生型コラーゲン（ネイティブコラーゲン）に対して、平滑筋細胞（SMC）の細胞拡がりを良くし、増殖を促進することがわかった。 あるメカニズム研究では、ネイティブコラーゲンがサイクリン依存性キナーゼ2（Cdk2）およびサイクリンE関連キナーゼのリン酸化を抑制する一方で、Cdk2阻害剤p21Cip1/waf1およびp27Kip1のレベルを上昇させることが提案された（Koyamaら、1996）。 この効果は、初代培養系における肺幹細胞の成長を制御するように見えた（Huangら、2010a）。 この系には、ストロマ細胞、肺幹細胞、およびI型コラーゲンが含まれていた。 コラーゲンのフィブリルサイズが大きくなると、間葉系ストローマ細胞の増殖と拡散が減少し、初代新生児肺細胞の増殖抑制につながる（Huangら、2010a）。 したがって、間葉系ストローマ細胞は肺上皮幹細胞の再生能力を直接制御するニッチ細胞として機能している。

動的機能的バイオインターフェース

ECMと細胞間の認識および制御機構をより理解するために、機能的自己組織化単層（SAM）に基づくいくつかのモデルシステムが確立されてきた（Robertsら、1998；Xiaoら、1998；Rezaniaら、1999）。 金表面上のアルカンチオレートのSAMは、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）およびオリゴ（エチレングリコール）（OEG）部位の混合物を提示することが可能である。 RGDはトリペプチドであり、細胞表面のインテグリン受容体に結合することにより細胞接着を促進することが見出されており、OEGは通常、タンパク質や細胞の非特異的吸着に抵抗するために用いられる。 RGDトリペプチド部分の分画と構造により、細胞接着の挙動を操作することができた。 このシステムにより、複雑な生物学的活性をある程度まで解明することができた。 しかし、前述のように、微小環境におけるECM構成要素（フィブロネクチン-コラーゲン、GAG-コラーゲン）の力学的特性や分子間相互作用が、細胞活性を大きく左右することがわかった。 さらに、表面上の比較的静的なリガンドは、細胞-ECM接触におけるダイナミクスを反映できない。

表面にランダムにタンパク質が沈着すると、細胞との相互作用を定義できないため、十分に特徴付けられたプラットフォームが必要である。 組織における細胞活動を精査するためには、特定のリガンドを固定化する機能、吸着した非標的タンパク質から誘発される誤解を招く細胞活動を防ぐ機能、拡張した水和ECM様構造の提示など、複数の機能を有するプラットフォームが必要である。 このように、基材が持つ機能性、非ファウリング性は、細胞増殖のプラットフォームとして重要である。 タンパク質の非特異的吸着に強く抵抗できる多くの非生物付着性材料（Ishihara et al., 1998; Chen et al., 2010; Jiang and Cao, 2010）の中で、脂質ベースの材料は、細胞-細胞および細胞-生体材料の相互作用を調べるために細胞膜様のミクロ環境を形成するので、生体系に最も適していると考えられている。 特に、細胞-細胞間や細胞-生体物質間の複雑な相互作用は、複雑な細胞内シグナル伝達過程や構造再編成など、様々な生体分子が時空間的に制御された高度に動的なものである。 それらは静的なSAMシステムで実施することはできない。 複雑な細胞膜とその関連プロセスをin vitroでモニターするために、移動度、密度、提示などのリガンド特性の制御が可能な動的合成材料を開発する。 モデル細胞膜である支持脂質二重膜（SLB）は、自己集合とリガンドの移動性、提示、および所定の位置での分布を可能にする動的機能的バイオインターフェースを構築するボトムアップアプローチを提供します（Kocer and Jonkheijm, 2018）。 したがって、本稿の焦点は、細胞膜の主要な特性およびECMとの相互作用を利用するための複雑な動的挙動を解明するために、機能性SLBを用いた細胞-ECMコンタクトを開発することにある。 SLBをベースに、RGDペプチド（Svedhemら、2003；Jensenら、2004；Ochsenhirtら、2006）や上皮成長因子（Namら、2006）などの小分子で修飾した機能性SLBを構築し、細胞応答を制御する研究が行われてきた。 しかし、微小環境の範囲と複雑さを広げるために、ECMタンパク質と機能化SLBとの結合によって構築された生体模倣系は、ECM成分と細胞との相互作用を説明するために、より適用可能である。 SLB上のECM成分の流動性、勾配、機械的特性、ナノ構造、分子間（例：コラーゲン-フィブロネクチン）および分子内（例：コラーゲン線維形成）相互作用を定義および評価し、微小環境における実際の細胞応答を探索できるため、この種の細胞培養プラットフォームを、プラスチック、金属、酸化物、SAMなどの固体上の他のものと区別することが可能である。 したがって、SLBは、非汚染性、水和性、横方向拡散性、リガンドの空間的位置と密度を制御する能力など、細胞膜に類似した独自の特性を持つ堅牢なプラットフォームを提供し、医学および工学における大きな可能性をもたらします（Sackmann、1996； Groves et al,

細胞外マトリックス支持脂質二重層システム

ECMと結合したSLBに基づく生体模倣細胞培養システムの先駆的研究は、Changのグループによって行われました（Huang et al.、2010b）。 彼らは、I型コラーゲンをSLB上で機能化し、細胞培養を確認するための基質として機能させ、細胞の挙動を調べることで、バイオミメティックなプラットフォームを構築した。 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(glutaryl) (DP-NGPE) と 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) からなる機能化脂質ベシクルをSiO2基板上に堆積しSLBとした（図 1）。 SLB中のカルボン酸官能基化リン脂質であるDP-NGPEのモル分率は0～40%に変化させた。 I 型コラーゲン機能化脂質二重層アセンブリを作成するために、ネイティブの I 型コラーゲン分子をチャンバー内に導入し、活性化した DP-NGPE 脂質を反応させ、アミンカップリング化学によってアミド結合を有する安定なコラーゲン-脂質コンジュゲートを形成させた。 タンパク質固定化の結合速度および膜厚，粘弾性，コンフォメーション，流動性などの膜特性を，QCM-D（Quartz Crystal Microbalance with dissipation），AFM（原子間力顕微鏡）およびFRAP（Fluorescence Recovery After Photobleaching）を用いてモニターした。 その結果，DP-NGPEの割合が高い機能化SLBに吸着したコラーゲンは，表面質量，粘弾性，フィブリル構造への自己組織化を増大させることがわかった。 FRAP のデータから，I 型コラーゲンを SLB に結合させると，横方向の脂質の移動度が最大で 20%減少することが示された。 平滑筋細胞（A10）は，コラーゲンなしの POPC/DG-NGPE 二重層やむき出しの POPC 脂質二重層とは異なり，規則正しく拡散・増殖した。 細胞膜とECMの主要な構成要素を含む単純なボトムアップのバイオミメティックシステムは、ECM要素や物理的手がかりに対する細胞の認識と応答を明らかにする機会を提供する

点分解能の研究に加え、ECM-SLBシステムにおける進化的な細胞反応も同じグループによって研究された（Huang et al.、2010c）。 この研究では、活性化DP-NGPEを含む機能化SLBにI型コラーゲンやフィブロネクチンを結合させ、生体模倣ECM微小環境を作製した（図2）。 このタンパク質結合系をQCM-Dにより、表面質量、粘弾性、コラーゲン-フィブロネクチン相互作用の観点から定量的に評価した。 また，タンパク質とのコンジュゲーションおよび細胞培養後のSLBの移動度の遅延をFRAPにより明らかにした。 NIH 3T3線維芽細胞をECM-SLB構築物上および酸素プラズマ処理したポリスチレン（PSo）上で培養し、並行して比較した。 ECM-SLB培養では、フィブロネクチン沈着SLB上で最も大きな細胞数および線維芽細胞の広がりサイズが認められた。 しかしながら、ECMコーティングしたPSoでは、すべてのタンパク質含有量において、そのような区別できる差は観察されなかった。 さらに、免疫蛍光染色のデータから、3T3細胞によって内因的に産生されるフィブロネクチンのPSoベース表面への吸着レベルは、SLBベースプラットフォーム上のそれよりも明らかに高いことが示された。 この結果は、SLBが持つ防汚性が、3T3細胞の微小環境のリモデリングを効果的に防ぐ上で重要な役割を担っていることを浮き彫りにしている。 一方、PSoベースのプラットフォームでは、ECMタンパク質の非特異的な吸着により、細胞は容易にリモデリングを行うことができる。 その結果、ECM-SLBプラットフォームは、ECM組成に対する細胞固有の反応や、それに続く細胞外環境とのシグナル伝達事象のモニタリングおよび制御に利用することができる。 NIH-3T3線維芽細胞の反応を調べるための機能化PSo- (A,C,E) およびSLBベース (B,D,F) のタンパク質吸着フィルムの作製過程。 無血清培養液中、細胞を6種類の表面上で6時間インキュベートした。 Huangら（2010c）から許可を得て転載 Copyright 2010 Elsevier Ltd.

Cho のグループは、アミンカップリング化学を介してフィブロネクチンまたはI型コラーゲンで機能化した低剛性SLB上での細胞の挙動を検討しました（Vafaei et al.、2017a）。 従来、プラスチック製の細胞培養プレートは極めて硬い基質を示し、生理的な微小環境において細胞が経験する実際の機械的剛性を反映することはできませんでした。 最近、ポリジメチルシロキサン（PDMS）などのエラストマーは、広い剛性領域を調節するために使用され、細胞応答におけるECMの機械的特性の役割に関する多くの重要な洞察を提供している（Englerら、2006年）。 しかしながら、SLBシステムは、生理的環境における細胞活動をモニターするために、最も柔らかく、最も流動的な界面にアクセスする機会を提供する。 双性イオン1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（DOPC）とDP-NGPEからなる脂質ベシクルを、次に溶媒補助脂質二重層（SALB）形成法によりSiO2カバースリップ上に沈着した（Tabaeiら、2014; Vafaeiら、2017b）。 リン脂質小胞の自然吸着と破裂を伴う従来の小胞融合法とは異なり、脂質組成と固体支持体のサブセットのみに限定される（Huang et al.、2010a、b、c）、SALB形成法は逆相蒸発現象に基づき、アルコール中の親水性固体表面に脂質が沈着する（Tabaei et al.、2014）。 SALB法は、Au、Al2O3、グラフェンなど、従来法では困難な様々な基材への適用に成功している（Tabaei et al., 2014; Jackman et al., 2015）。 SALB支援SLBにI型コラーゲンやフィブロネクチンのECMタンパク質をケミカルコンジュゲートした。 QCM-D研究を行い、SLB上のECMはSiO2に吸着した場合よりも密度が低く、高い構造的柔軟性を有することが分かった（Vafaei et al.、2017b）

さらに、細胞接着研究のためにSLBベースの低剛性基板をタイプIコラーゲンまたはフィブロネクチンで機能化した（Vafaei et al.、2017a）。 SLB中のDP-NGPEおよびコレステロールのモル分率を制御することによって、SLBの横方向の流動性を細かく調整した。 蛍光画像から、二重層上の細胞の特異的な接着は、ECMタンパク質の濃縮と、細胞の周りの枯渇のゾーンの出現によって示された。 高コレステロール二重膜上では、>10%の細胞がフィブロネクチンまたはコラーゲンのいずれかが枯渇していることが示された。 これはECMタンパク質の横方向への移動が減少したためと考えられるが、この移動は下層の二重膜の粘性によって制御されている。 したがって、コレステロールを添加したECM-SLBプラットフォームは、神経組織のような極めて低剛性の表面への細胞接着を必要とする生物医学的応用のために、様々な基質剛性を提供するものである。

より密接に細胞微小環境を模倣するプラットフォームの開発のために、SLBを天然の脱細胞化細胞外マトリックス（dECM）で機能化し、3D-立体構造を保持し、ヒト肝細胞の生存および接着をサポートする（図3）（Vafaei et al, 2018). dECMはマウスの死体から抽出し、クロロホルム/メタノール混合溶液を用いて脱細胞化した。 dECMは、GAG、コラーゲン、フィブロネクチンを含む。 DP-NGPEとDOPCを含むSLBにdECM成分をアミンカップリング化学で結合させた。 QCM-Dは二重層の形成とその後のdECMの沈着の速度論をモニターするために使用された。 FRAPの結果、dECMで機能化した後の膜の流動性が確認された。 このプラットフォームは細胞の生存と接着をサポートし、代表的な肝細胞の機能を維持する。 また，組織由来dECMの存在下で，成長因子受容体や細胞結合性リガンドが横方向に集積・組織化し，豊富な生化学的プロファイルを有することが確認された

Haoらは、ECM-SLBの機械的特性が神経幹細胞（NSCs）の分化に及ぼす影響を報告した（Hao et al.、2018）。 SLBは，流動的なECMの動的特性を模倣するための培養プラットフォームとして使用された。 SLBの流動性は、基材の表面特性によって細かく変化させた。 SLBは1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-PE), 1,2-dimyristoill-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), および 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-posphoethanolamine-N-(succinyl) (Succinyl-PE) から成っており、SLBはこのうちの1つである。 FRAP測定から，ピラニア処理ガラス上のSLB（P-SLB）は，cholesteryl chloroformate tether-modifiedガラス（CC-SLB）およびキトサンmodifiedガラス（Cs-SLB）に比べて高い流動性を示している． また，CC-SLBはCs-SLBに比べ流動性がやや低いことがわかった。 続いて，異なる基板上のSLBにフィブロネクチンを物理吸着させた。 その結果、NSCsの挙動はSLBの流動性に大きく関係していることがわかった。 流動性の低いSLB上では、細胞接着の促進、細胞の伸縮形態、ストレスファイバーの緻密なネットワーク、神経細胞の分化の促進が観察された。 逆に、流動性の高いSLBでは、接着斑の形成が少なく、細胞形態が丸く、ストレス線維が未熟で、アストロサイトの分化が多く見られた。 その結果、FAK-MEK/ERKシグナル伝達経路の活性化が、低流動性SLB上でのNSCsの接着斑形成の促進、ひいては神経細胞分化の促進に重要な役割を果たすことが明らかになった。 この研究は、幹細胞の挙動に対する動的なECMの効果についての洞察を提供するとともに、幹細胞アプリケーションの有効性を向上させる。

SLB上のテザーリポソームは、DNAハイブリダイゼーション（Benkoski and Hook, 2005; Yoshina-Ishii et al. テザーリポソームシステムは、タンパク質-脂質およびタンパク質-タンパク質相互作用の研究のための膜タンパク質の再構成、ならびに単一生体分子検出のためのタンパク質のカプセル化に応用された。 ポリエチレングリコール（PEG）、フィブロネクチン、およびコレステロール含有リポソームを用いて、ECM-SLBを含む生体模倣構築物が形成された（Tseng and Chang, 2012）。 SLBは、機能的な1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap-biotinyl（b-PE）および双性イオンPOPCから作られていた。 薬剤封入リポソームはビオチン-ストレプトアビジン相互作用により固定化された（図4）。 リポソーム-SLB コンストラクトは、薬物放出と細胞接着のための多機能プラットフォームとして機能する。 フィブロネクチン-リポソーム-SLBモデルプラットフォームの形成は、QCM-Dを用いてin situでモニターされた。 また、リポソームがSLBに固定される際の優れた安定性は、カプセル化された蛍光プローブを介して確認された。 その結果，<蛍光プローブコンテンツの20%が8日間で放出されることがわかった。 HeLa細胞をフィブロネクチン-リポソーム-SLBプラットフォーム上で培養し、細胞間相互作用を調査した。 フィブロネクチンはプラットフォーム上でのHeLa細胞の接着を促進するのに重要であることがわかった。 そのため、細胞接着時にリポソームが空間的に再編成され、細胞に取り込まれることがわかった。 ドキソルビシン負荷リポソームの表面密度は、HeLa細胞のアポトーシスを決定し、リポソームによる薬物送達の有効性を確認した。 したがって，この多機能モデルプラットフォームは，細胞および組織ベースのアッセイにおける事前投与，制御放出システムとして有益であると考えられる。 ビオチン化脂質二重層（FN-リポソーム-SLB）をベースにしたフィブロネクチン-リポソーム機能化表面。 モデル表面の構築は5つのステップを含む。 (I) SLBの形成、(II) ストレプトアビジン結合の第一層、(III) b-PEGリポソームの固定化、これは色素標識脂質を含むか、DOX/蛍光色素をカプセル化することができる、 (IV) ストレプトアビジン結合の第二層、 (V) ビオチン化フィブロネクチン（bFN）の固定化である。 Tseng and Chang (2012)の許可を得て再掲載。 Copyright 2012 American Chemical Society.

ECMタンパク質に加えて、GAGは組織において、支持体の提供、細胞の分化と分裂の仲介、タンパク質との重要な相互作用に関与するなどの複数の機能を発揮している。 GAGに関連した相互作用の理解は本質的に難しく、適切で定義されたプラットフォームが必要である。 Svedhemらは、GAGであるコンドロイチン硫酸（CS）を流体SLBに化学的に結合させるための2つの固定化戦略を示した：1, 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（ラウロイルアミン）（DOPE-NH2）；2. カルボキシ官能化リン脂質、例えば1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（ラウロイル）（DOPE-COOH）を活性化して、続いてヒドラジド-機能化CSを付加することにより (Altgarde et al, 2013). SLBの形成とその後のコンジュゲーションは、QCM-Dを用いてin situで追跡した。 その結果、2つの戦略により、同様の粘弾性特性を持つCS薄膜が得られた。 また、脂質二重層の流動性はCSのコンジュゲーションに影響されなかった。 このように、開発したCSプラットフォームのSLBへの応用は、骨誘導成長因子である骨形成タンパク質-2への適用を例示している。

まとめと展望

in vitroにおける細胞の増殖と制御のためのマイクロ環境の構築は依然として難しい。 ECMの流動性、勾配、力学的特性、ナノ構造、分子間および分子内の相互作用など、通常の細胞培養システムにはない複雑さがある。 ECM成分を結合させたバイオミメティックSLBシステムは、生体内の微小環境における実際の細胞反応に光を当てている。 SLBは、流動性、耐ファウリング性、汎用性、生体適合性といったユニークな特性を備えている。 現在までのところ、同じ目的に使用できる代替物は見つかっていない。 SLB-ECMプラットフォームの物理的特性は、QCM-D、AFM、FRAPなどの高度な機器を適用して、細胞反応を相関させることで明確に定義することができます。 さらに、細胞の増殖に伴いECM組成や構造が持続的に変化するため、SLB-ECMプラットフォーム上での細胞の動的挙動を追跡することに価値があるはずである。 SLB-ECMプラットフォームでは、細胞とその微小環境との間の特異的な認識相互作用を観察することができ、人工培養システム上での生物学的活性を直接的に反映させることが可能である。 SLB-ECMプラットフォームは、基礎研究にとどまらず、創薬スクリーニング、希少細胞捕捉、再生医療、バイオセンシングなど、さまざまな応用が期待されています。

Funding

MOST 105-2628-E-008-007-MY3; 106-2119-M-194-002; 107-0210-01-19-01; 107-2119-M-001-039 from Ministry of Science and Technology (MOST, Taiwan) and Academia Sinica, Taiwan.The Framework of Science and Technology and Science and Technology (MOST and Science).

利益相反声明

著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言している。

謝辞

このプロジェクトの財政的支援について、科学技術省（MOST 105-2628-E-008-007-MY3; 106-2119-M-194-002; 107-2119-M-001-039）に感謝する。