Frontiers in Medicine

はじめに

ほとんどの患者の腸の健康を評価する方法として大腸内視鏡検査は好まれており、大腸がん診断のゴールドスタンダードとして腸内病変を明確に発見できる (1). 大腸内視鏡検査の前には、調整食や関連薬剤の活用により、検査過程や結果に影響を与える腸管壁の残留物がないようにするための整腸剤が一般的に用いられており、整腸剤の適切性は大腸内視鏡検査の最終効果に直接影響します（2）。 現在、大腸内視鏡検査前の腸管洗浄には、その有効性と受容性の高さから、ポリエチレングリコール（PEG）が広く用いられています（3）。 生理的な条件下では、共生生理的嫌気性菌、共生条件下病原性菌、その他の有害菌が安定した割合で腸管内に共存しています。 しかし、腸内細菌叢が変化したり、腸内細菌叢の割合がバランスを崩すと、それに対応した病態生理学的変化が生じる(4)。 整腸剤の服用により腸管運動障害や腸管蠕動運動が亢進し、細菌が腸管粘膜に付着しにくくなる(5)。 また、整腸剤によってもたらされる大量の酸素が腸内環境に含まれることで、嫌気性菌が激減し、好気性菌の増殖が促進され、腸内細菌の乱れが生じます（6）。

プロバイオティクスとは「十分量を摂取すると宿主に有益な作用を及ぼす生きた微生物」（7）ですが、これまでの研究から、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、大腸癌など様々なヒト疾患においてプロバイオティクスが活性化しているとされています（8、9）。 私たちのこれまでの研究では、プロバイオティクス製剤が胃瘻造設後の炎症反応を抑え、術後患者の胃腸症状を改善する重要な効果を持つことが示され（10）、またプロバイオティクス製剤は上咽頭癌患者の放射線治療による口腔粘膜の炎症を有意に緩和しました（11）。 整腸剤の副作用については注目されているが、例えば、以下のようなものがある。 本研究では、臨床用プロバイオティクス医薬品であるBifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tabletsを用い、整腸剤投与ボランティアに対する効果を評価し、プロバイオティクスが整腸剤による腸内細菌叢障害に良い影響を与えるかどうか、ハイスループットシークエンスにより評価した。

材料と方法

倫理声明

本研究は、南昌大学第二付属病院（中国・南昌）の施設審査委員会により承認されました。 患者はサンプル採取に際して書面によるインフォームドコンセントを提供した。 また、中国臨床試験登録センター（ChiCTR1900022539）により登録・承認されています。

試験デザインおよび患者登録

試験は2018年12月から2019年11月にかけて中国南昌大学第二付属病院において実施されました。 平均年齢51歳（範囲30～70歳）、身長1.66m、体重61.78kg、肥満度（BMI）22.39の被験者32人（男性29人、女性3人）が登録されました。 高血圧歴5名，糖尿病歴4名，高血圧・糖尿病歴3名であった。 規則に従い、研究過程での投薬は中止されなかった。 さらに、対象中に抗生物質を服用した参加者はおらず、最近感染症を発症した参加者もおらず、その他プロバイオティクスやヨーグルトの服用もなかった。 これらのボランティアは誰もベジタリアンではなかった（表1）

Table 1. ベースライン患者の人口統計学および特性。

Trial Protocol

32人のボランティアは、プラセボ群（C群、n＝16）およびプロバイオティクス群（P群、n＝16）の2群に分割された。 プロバイオティクス（ビフィドバクテリウム・テトラジェナス生菌錠（SiLianKang）、杭州大生物医薬有限公司、中国杭州市、以下同じ。 SFDA承認番号。 S20060010，>0.5×106CFU/表 Bifidobacterium infantis，>0.5 × 106CFU/表 Lactobacillus acidophilus，>0.5 × 106CFU/表 Enterococcus faecalis，>0.5 × 105CFU/表 Bacillus cereus含有）であった． 腸管造影検査の前日には，おかゆや麺類など繊維質の少ない食事を摂るように指示し，大腸内視鏡検査後には通常の食事を摂らせた． 治療中は抗生物質の使用はもちろん、飲酒や険悪な雰囲気も禁じられた。 6597>

参加者は2Lのポリエチレングリコール（PEG、SFDA承認番号：H20020031、パッケージA：0.74g塩化カリウムと1.68g重炭酸ナトリウム、パッケージB：1.46g塩化ナトリウムと5を含む。リドカイン塩酸塩注射液1ml（SFDA承認番号：H37021309）、ナルブフィン塩酸塩注射液1ml（SFDA承認番号：H20130127）およびプロポフォール乳剤注射液20ml（SFDA承認番号：H20051843）による静脈内麻酔後、結腸鏡検査が実施されました。 参加者が大腸内視鏡検査中に耐えられない場合は、適宜麻酔薬を追加した。 3回ピント（3日前、大腸内視鏡検査直前の整腸剤と同日、処理後7日）の糞便を採取した。 採取したサンプルは50%グリセロール（Cat#56-81-5; Sengon Biotech, China）で保存し、すぐに-80℃で保存し、さらに使用した。

Total Bacterial Genomic DNA Extraction and High-Throughput Sequencing

計96個の便サンプルを採取し、ビーズブラストをゲノムDNAキット（天健バイオテック社、中国、北京）と組み合わせた方法で便中微生物のDNA抽出（12） を行った。 精製 DNA の濃度と純度は、230 nm (A 230) と 260 nm (A 260) の分光光度計 (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) を介して測定した。 各サンプルの16S rDNA遺伝子のV4領域は、515F／806R primer（515F, 5′-GCACCTAAYTGGGYDTAAAGNG-3′; 806R, 5′- TACNVGGTATCTAATCC-3′）, PCR産物をIlluminaHiSeq 2000プラットフォームで配列決定した（GenBank accession number PRJNA597277）(13).

データ解析

ハイスループットシーケンスデータを解析するために、Cutadapt（バージョン1.9.1、http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）、UCHIMEアルゴリズムhttp://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html、UPARSEソフトウェアパッケージ（バージョン7.0.100）、QIIMEソフトウェア（バージョン1.9.1）、QIIMEソフトウェアパッケージ（バージョン1.8.0）、SIMCA-Pソフトウェア（バージョン11.0）。5; Umetrics; Sartorius Stedim Biotech, Malmö, Sweden）を用いて、α多様性（サンプル内、観測OTUの指標、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、物品カバー）およびβ多様性（サンプル間、PCA、PCoA、NMDS）を求めた（14、15）

データは平均±標準偏差（SD）として表示されています。 統計解析はPrismソフトウェア（バージョン7.0；GraphPad Software, San Diego, CA, USA）およびSPSS 17.0 software（SPSS Inc.） 統計的有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）、Tukeyの多重比較検定およびF検定を使用して決定した。 P < 0.05の誤差確率を統計的に有意とした。

結果

患者のベースライン特性

2018年12月から2019年11月の間に、32人のボランティアがプラセボ群（C群、16人）およびプロバイオティクス群（P群、16人）に登録し、性別、年齢、BMI、ベースライン特性、過去の病歴、整腸前後の胃腸反応などが表1に要約されている。 C群とP群の間に有意差はなかった。

Effect of Bowel Preparation on Intestinal Microbes

腸管準備が腸内微生物に影響を与えるかどうかを調べるために、腸管準備前（CB群）、中（CM群）、後（CA群）ボランティア16名の糞便から16S rDNA amplicon sequencing法により細菌のV4超変量領域を増幅させた。

図1A-Cにおいて、Shannon index、Simpson index、Observed speciesは、腸内細菌群集のα-多様性に、CB群とCM群、CB群とCA群の間では腸調製の発生がわずかに影響し、CM群とCA群の間では微生物の多様性に有意に影響することを示した（P < 0.05）。 また、主座標分析（PCoA）により、CM群とCA群の微生物多様性は、CB群と比較して異なることが示された（図1D）。 さらに、Venn index（図1E）の結果、CB群、CM群、CA群にはそれぞれ2,068、3,426、1,695のOTUが存在し、その共通OTUの割合はそれぞれ27.71%（573/2,068）、16.73%（573/3,426）、33.81%（573/1,695）であることが分かった

FIGURE1. 腸内細菌叢に対する整腸剤の効果。 (A）、シャノン指数、（B）、シンプソン指数、（C）、観察種、（D）、β多様性指数のPCoA、（E）、スカラー-ベン表示。 CB、腸管準備3日前の対照群（n = 16）、CM、腸管準備中の対照群（n = 16）、CA、腸管準備5-7日後の対照群（n = 16）。 ns, P > 0.05; *P < 0.05.

さらに、門レベルで優占細菌を解析したところ（図2A〜E）、これら3群ではProteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteriaが優占であることが判明した。 その結果、腸管処理により、CB群と比較して、Proteobacteriaの相対量が増加（0.266 vs. 0.410）、Actinobacteriaの相対量が減少（0.044 vs. 0.029）、FirmicutesとBacteroidetesはわずかに影響を受けた（0.462 vs. 0.408 ）と報告された。 腸管処理後7日目には、Proteobacteriaの相対量が0.410から0.335に減少していた。 一方、Firmicutes (0.409 vs. 0.389) とBacteroidetes (0.136 vs. 0.126) は依然としてCM群に比べ減少傾向を示したが、不思議なことにActinobacteriaは0.029 から 0.119 に増加し、Firmicutesの相対存在量はCM群に比べ減少傾向にあった。 属レベルでみると（図2F-J）、整腸剤投与中はBacteroidesとAcinetobacterが優勢であり、Acinetobacterの相対量（0.042 vs. 0.126）はCM群と比較して減少傾向を示した。 0.176) が有意に増加し、Streptococcus (0.020 vs. 0.008), Bifidobacterium (0.036 vs. 0.022), Faecalibacterium (0.075 vs. 0.065) はCB群と比較してわずかに変化していることが確認された。 しかし、整腸剤投与7日後には、Streptococcus (0.007 vs. 0.068) とBifidobacterium (0.022 vs. 0. 0)の割合が有意に増加した。109）、Faecalibacterium（0.065 vs. 0.031）Acinetobacter（0.176 vs. 0.136）の相対量がCM群に比べ減少した

FIGURE 2. 腸管調製が門・属レベルの微生物組成に及ぼす影響。 (A）、門レベルでの腸内細菌叢の相対的存在量；（B）、Proteobacteria；（C）、Bacteroidetes；（D）、Firmicutes；（E）、Actinobacteria。 (F), 腸内細菌の属レベルでの相対的存在量； (G), Acinetobacter; (H), Bifidobacterium; (I), Streptococcus; (J), Faecalibacterium.腸内細菌叢は、腸内細菌の属レベルでの相対的存在量を示す。 CB、腸管準備3日前の対照群（n = 16）、CM、腸管準備中の対照群（n = 16）、CA、腸管準備5-7日後の対照群（n = 16）。 ns, P > 0.05; *P < 0.05.

Effect of Probiotic Preparation on Intestinal Microbiota

腸管準備を受けるボランティアの腸内微生物相に対するプロバイオティクスの効果を評価するために、7日間腸管準備前（PBグループ）、腸管準備中（PMグループ）および腸管準備後（PAグループ）の糞便が集められました（5〜7日間プロバイオティクス調製品を摂取したことがある）。

PB群とPM群では、整腸剤が微生物群集のシャノン指数（図3A）およびシンプソン指数（図3B、P < 0.05）のα-多様性に顕著な影響を与えることが確認されました。 興味深いことに、Observed speciesは腸管処理後に明らかに増加したが、処理後7日目には明らかに減少した（図3C）。 さらに、PCoAの結果は、プロバイオティクスの服用により、PM群とPA群では乱れた微生物相が正常なレベルに大きく回復し（図3D）、共通のOTUは、PB、PM、PA群でそれぞれ全OTUの28.68％（508／1771）、23.67％（508／2146）、36.92％（508／1376）占めたことが示された。 腸内細菌叢に対するプロバイオティクスの効果。 (A）、シャノン指数、（B）、シンプソン指数、（C）、観察種、（D）、β多様性指数のPCoA、（E）、スカラー-ベン表示。 PB、腸管準備3日前のプロバイオティクス群（n = 16）、PM、腸管準備中のコントロール群（n = 16）、PA、腸管準備後5-7日のプロバイオティクス群（Supplement the Bifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tablets after colonoscopy, up to 5-7 days, 3 tablets and three times a day）（n = 16）. データは平均値±SDで示した。ns, P > 0.05; *P < 0.05.

次に、さらにプロバイオティクス介入の微生物組成への影響を評価したところ、プロバイオティクスを補充することでProteobacteria（0.5%）を著しく減少させた。515 vs. 0.173）、PM群ではPA群と比較してBacteroides（0.166 vs. 0.338）の相対存在量が門レベルで急激に増加した（P < 0.05）。 属レベルでは、PM群ではPA群に比べて明らかにAcinetobacterの割合が減少し（0.204 vs. 0.071）、Bifidobacteriumの割合が有意に増加した（0.04 vs. 0.071）。また、PM群ではPA群と比較して、Bifidobacterium (0.017 vs. 0.110), Bacteroides (0.095 vs. 0.155), Faecalibacterium (0.028 vs. 0.060) の割合を有意に増加させた（図4F-J）。 門および属レベルでの微生物組成に対するプロバイオティクスの効果。 (A）、門レベルでの腸内細菌叢の相対的存在量、（B）、タンパク質、（C）、バクテロイデーテス、（D）、ファーミキューテス、（E）、アクチノバクテリウム。 (F）、属レベルでの腸内細菌叢の相対的存在量；（G）、Acinetobacter；（H）、Bifidobacterium；（I）、Bacteroides；（J）、 Faecalibacterium. PB、腸管準備3日前のプロバイオティクス群（n = 16）、PM、腸管準備中のコントロール群（n = 16）、PA、腸管準備後5-7日のプロバイオティクス群（Supplement the Bifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tablets after colonoscopy, up to 5-7 days, three tablets and three times a day）（n=16）。 データは平均値±SDで示した。 ns, P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01.

The Microbial Changes Between Groups CA Group and PA Group

Probiotics on bowel preparationの効果をより理解するために、CAとPAのグループのボランティア間で微生物の多様性を比較した。 図5A-Cに示すように、プロバイオティクスの補充は、シャノン指数とシンプソン指数（P < 0.05）を顕著に高め、観察された種は減少していた。 PCoAの結果、CA群とPA群のサンプルは互いに離れて散らばっていることがわかった（図5D）。 CA群とPA群のOTUはそれぞれ1,695と1,376であり、共通のOTU数は570であった（図5E）。 また、Lefse解析の結果、Bacteroidia（クラス）、Bacteroidetes（門）、Bacteroidaceae（科）、Bacteroides（属）、Fusobacteriaceae（科）、Porphyromonadaceae（科）、Parabacteroides（属）はPA群でCA群より有意に多かった（Figure 5F）。

次に、CA群とPA群の特定細菌を比較した。 プロバイオティクスを添加した場合、PA群と比較して、門レベルでBacteroidetesの割合が著しく増加し（0.126 vs. 0.338）、Proteobacteria（0.335 vs. 0.173）, Firmicutes（0.389 vs. 0.330）の割合は減少した（P < 0.05）. 属レベルでは（図6E-K）、プロバイオティクスの補充により、Acinetobacter（0.136 vs. 0.071）とStreptococcus（0.068 vs. 0.023）の相対存在度が低下し、一方でBacteroides（0.068 vs. 0.155）、Roseburia（0.02 vs. 0.04）、Faecalibacterium（0.031 vs. 0.060）およびParabacteroides（0.16 vs. 1.92％）の相対量が増加した。 門および属レベルでのグループCAおよびPA間の微生物組成に対するプロバイオティクスの効果。 (A）、門レベルでの腸内細菌叢の相対的存在量；（B）、プロテオバクテリア；（C）、バクテロイデーテス；（D）、ファーミキューテス。 (E)は腸内細菌の属レベルでの相対量，(F)はAcinetobacter，(G)はBacteroides，(H)はStreptococcus，(I)はRoseburia，(JはFaecalibacterium，(KはParabacteroides). CA、コントロール群 整腸剤投与5-7日後（n = 16）、PA、プロバイオティクス群 整腸剤投与5-7日後（ビフィドバクテリウム・テトラジェナス生菌錠を大腸検査後に最大5-7日間、3錠、1日3回補充）（n = 16）。 データは、平均値±SDで示した。 *P < 0.05.

Discussion

Bowel cleaning is necessary during colonoscopy, and its long-time use of safety is ignore its negative impact on intestinal microorganisms (16).Bowel cleaningは、大腸内視鏡検査において必要であり、その安全性のために長い間、人々は、腸内微生物への悪影響を無視している。 ご存知のように、大腸微生物は血管新生、代謝、消化、免疫系の発達など、正常な哺乳類の生理機能を促進する基礎となるものです(17)。 さらに、腸内細菌叢のバランスが崩れると、肥満、2型糖尿病、大腸がん、炎症性腸疾患などの様々な病気が引き起こされます（8, 9, 18）。

正常な腸内微小生態系の主成分は偏性嫌気性菌（BacteroidetesとFirmicutes）であり、通性嫌気性菌（Proteobacteriaなど）の占める割合は通常少なく、腸内細菌叢のアンバランスは通性嫌気性菌が増加することによって生じることが多いとされています(19)。 整腸剤は、腸管内に大量の酸素をもたらし、腸管の嫌気性環境を損ない、通性嫌気性菌や好気性菌の良好な増殖環境を提供することができる。 これまでの研究および本研究では、同様に、整腸剤がProteobacteriaの存在量を大幅に増加させることを示した。

本研究では、整腸剤がBacteroidetesとFirmicutesの門を著しく減少させ（図2）、プロバイオティクスを服用しても、Firmicutes門にはほとんど影響がない一方で、Bacteroidetesの存在量を大幅に増加させている（図4）ことが判明した。 これまでの研究で、ファーミキューテス門の増加やバクテロイデテス門の減少は、不健康な状態と密接に関係していることが分かっていました。 したがって、Firmicutes/Bacteroidetesの増加は、患者の健康に対する潜在的なリスクとなる可能性がある(20-22)。 本研究では、CA群（3.08）のFirmicutes/Bacteroidetesの比率はPA群（0.98）よりも高く、プロバイオティクス摂取により整腸による潜在的疾患リスクを軽減できることが示唆された。 また、通常、人間の体は、大腸に到達するまでは、複合多糖類（毎日の食事の主成分で主な栄養源）のほとんどを分解する能力を持っておらず、バクテロイデテスは、セルロース、ペクチン、キシランの複合多糖類の分解に重要な役割を果たし、食事からのエネルギー吸収を助けることができる(23)。 さらに、バクテロイデテスが生産する酪酸は、宿主の腸の健康を維持し、免疫や抗腫瘍効果を発揮するのに重要な役割を果たしている（24）。属レベルでは、プロバイオティクスの補充は、特に免疫機能の低い患者の病院感染を引き起こす重要な病原体に属する、自然界にありふれた好気性のグラム陰性菌であるアシネトバクター（アシネトバクター・バウマニ）の存在度を大幅に減少させました(25)。 アシネトバクターは、韓国の病院の集中治療室で3番目に多いヒトの病原菌としてリストアップされており、さまざまな抗生物質に対する固有の薬剤耐性によって、さまざまな抗菌薬に対する薬剤耐性の決定要因を得ている（26）。 さらに、整腸剤はバクテロイデスのレベルを著しく低下させ、プロバイオティクスはその存在量を明らかに回復させた。 バクテロイデスは腸内酸素濃度を低下させ、厳密な嫌気性菌の増殖を促進することが研究で明らかにされており（23）、ビフィドバクテリウムのいくつかの株は食品や医薬品のプロバイオティクスとして使用されている（10, 27）。 BacteroidesやBifidobacteriumは、宿主と長期にわたって安定的に接触し、人体の健康に寄与するとともに、食物繊維を短鎖脂肪酸（SCFA）に分解し、細胞のエネルギー源としたり、バリア機能を促進し、炎症反応の発生を抑制することができる（28, 29）。

最後に、CAとPAの微生物多様性を比較したところ、プロバイオティクスを摂取することでRoseburiaなどの善玉菌の豊富さが優位に高まり（主に、あるいは唯一酪酸を生成し、全体、特に血液中の炎症のレベルを下げることができ、さらに動脈硬化の程度を下げることができました。 心血管疾患を持つ人ではより低いレベルのままである）（30、31）、Faecalibacterium（動物や人間の消化管に広く存在する共生細菌。 クローン病患者では有意に減少しており、クローン病の治療にプロバイオティクスとして利用できるかもしれない）（32-34）、属レベルではParabacteroides（腸の炎症に抵抗できる、主な代謝最終産物は有益な酢酸とコハク酸で、大腸炎患者の腸管では正常範囲より低い）（35-37）などが知られています。 それにもかかわらず、Streptococcusなどの有害菌の存在量は著しく減少していた（図5、6）。 Streptococcusは、化膿性連鎖球菌、Streptococcus viridans、Streptococcus pneumoniaeなどの日和見病原体で、化膿性炎症、心内膜炎、敗血症を引き起こし、人の健康や生命をさらに脅かす（38, 39）。 Haenniらは、世界の動物分野でテトラサイクリン系、マクロライド系、リンコサミド系の抗生物質が広く使用されているため、Streptococcus zooepidermidisの抗生物質耐性が出現し、治療の失敗につながっていると指摘している（40, 41）。

本研究では、経口プロバイオティクスが整腸剤による腸内細菌の乱れを緩和し、Proteobacteria（門レベル）、Acinetobacter（属レベル）の病原体を大幅に減少させることを見出した。 Streptococcus（属レベル）、Bacteroidetes（門レベル）、Bacteroides（属レベル）、Roseburia（属レベル）、Faecalibacterium（属レベル）、Parabacteroides（属レベル）のプロバイオティクスが強化されたのです。 したがって、プロバイオティクス製剤の補充は、腸内洗浄後の腸内細菌バランスの確立を促進し、有害細菌の増殖を抑制し、腸の健康維持に役立つと考える理由がある」

Data Availability Statement

この研究のために作成したデータセットがNCBIにあります。 GenBank accession number PRJNA597277.

Ethics Statement

人が参加する研究は、南昌大学第二付属病院（中国、南昌）の機関審査委員会の審査と承認を受けた。 また、本プロジェクトは、中国臨床試験登録センター（ChiCTR1900022539）により登録・承認されています。 6597>

Author Contributions

TC と XD は実験をデザインし、データを分析し、原稿を書いた。 CZ、HT、RY、ZL、YH、KWは実験を行った。 6597>

資金

この研究は、中国国家自然科学基金（XDにグラント番号81960103）、江西省自然科学基金（ZLにグラント番号20192AKBL20034）、江西省科学技術プロジェクト（グラントNos. 20181BBG70028、20181BCB24003、20194BCJ22032 to TC）、江西省ダブル万計画 to TC（ハイエンド人材としてのイノベーションと技術専門家）である。

Conflict of Interest

The authors declare that the research was been conducted in any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.