Kinetically limited differential centrifugation as inexpensive and readily available alternative to centrifugal elutriation

多くのアプリケーションにおいて、密度は同じだがサイズが（わずかにまたは大幅に）異なる他の細胞を含む混合物から標的細胞を分離することが望まれています。 例としては、（そのサイズによって特徴付けられる）その周期の特定の段階にある細胞を分離する同期化細胞培養物の生成（1-2）、他の下垂体細胞からの副腎皮質刺激物の分離（3）、及び単球の様々な亜集団の選別（4）などがある。 沈降速度の違いに基づいて細胞集団を分離する方法（特に密度の違いが大きくない場合）として、遠心エルトリエーションと呼ばれるプロセスが選ばれている(5)。 ここで、セパランド（通常、細胞）には2つの力が作用する。 (i) 細胞をその密度とサイズの関数である速度で沈降させる遠心力、および (ii) すべての細胞に一定の速度を与える逆方向の対流力である。 この流れや遠心分離の速度を調節して、沈降速度が特定の範囲にある細胞のみを回収することも可能です。 このプロセスは、細菌細胞が存在するマトリックスから細菌細胞を分離するのにもうまく使われているが(6)（我々の関心のあるアプリケーション）、特殊な装置が必要なため、多くのラボにとって障害になっている。

食品（7-8）、土壌（9）、微生物マット（10）などのさまざまなマトリックスから細菌を分離するために、容易に入手できるベンチトップ遠心分離機を使用して、異なる沈降速度に基づいて細胞を分離するプロトコルについて多数説明されているが、推奨されるプロトコルはしばしばアドホックであると思われる。 例えば、Wangら（8）は、ソフトチーズから細菌を分離する際、ゴミを取り除くために<1000×gで不特定時間遠心分離し、その後、細菌を集めるために9000×gで3分間遠心分離することを推奨している。 同様に、ホモジナイズした肉から細菌を分離する場合、Neiderhauserら（7）は、100×gで遠心分離（時間不定）して食品粒子を除去し、その後3000×gで遠心分離（これも時間不定）して細菌を収集することを推奨している。 また、推奨されるプロトコルは、複数回の遠心分離を含む場合もある。 例えば、微生物マットから細菌を分離するために、Beyら（10）は、500×gで15分間遠心分離するだけでなく、沈殿物を再懸濁し、その手順を4回繰り返すことを推奨している。 同様に、土壌から細菌を分離するために、Bakken (9) は、サンプルホモジネートを 630-1060×g で（不特定の時間）遠心分離し、その後、再懸濁と再ホモジネーションを繰り返すことを推奨している。 同様のアプローチは、「陽性」血液培養ブロスから細菌を単離するためにも提案されている。 MALDI-TOF質量分析を用いて細菌の同一性を決定する前に、細菌の純粋な単離物を得るために、Stevensonら（11）は、8500、1000、および13000RPM（gの値は特定されない）でそれぞれ「1〜2分」の連続した遠心分離ステップと各ステップでペレットの異なるバッファへの再懸濁を含む多段階遠心分離手順を使用した。

これらの引用されたプロトコルは、遠心分離速度および/または時間の明らかに任意の選択によって特徴付けられるアドホック遠心分離プロトコルの唯一の例では決してない。 このようなアドホックなプロトコルの重要な帰結は、他の人が他のマトリックス/混合細胞から異なる標的細胞を分離するためのプロトコルを考案するための、いかなる合理的な根拠も提供しないことである。 例えば、長時間の遠心分離はすべての粒子を沈降させるが、短時間の遠心分離は最も速い粒子のみを沈降させ、最も遅い粒子を懸濁液に残すことは直観的に明らかである。 しかし、遠心分離の最適な速度/時間を決定して、目的の粒子を分離し、他の粒子を除去することは、より技術的な課題として残っています。 言い換えれば、現在報告されているプロトコルは、他の関連する分離/単離目的のための修正（最適な遠心分離速度/時間の決定）に対する合理的な根拠を提供しないのです。 プロセスの最初（図1(1)）に、分離体（白血球またはWBC、赤血球またはRBC、血小板、細菌）を含む懸濁液（我々の場合、血液培養ブロス）を、透明な高密度緩衝液（我々の場合、ヒストパック1083）の上に分離層として装填する。 バッファーの密度は、白血球（ρ = 1.06 – 1.08 g/mL (12)）や血小板（ρ = 1.05 – 1.07 g/mL (13)）より大きく、赤血球（ρ = 1.1 g/mL (14)）や細菌（大腸菌ではρ = 1.105 g/mL (15)）よりは小さくなっています。 遠心分離が進むと、すべての粒子が下方に押し出され、まず最上層（血液培養液）を通過し、次に高密度緩衝液（ヒストパック）へと入っていく。 緩衝液の密度より大きい粒子（赤血球および細菌）は血液培養ブロスと高密度緩衝液の両方を通過して沈殿するが、密度の低いセパランド（WBCおよび血小板）は後者から排除される。 このプロセスは、全血からWBCと血小板を分離するために推奨されているプロトコルと同様である(16)。 しかし、このプロセスだけでは、目的の粒子（バクテリア）から密度の違いに基づいて望ましくない粒子（WBCと血小板）が取り除かれる一方で、同じような密度を持つ他の粒子（RBC）が残るため、我々の目的には不十分である。 そこで、目的粒子（細菌）をすべて回収し、残った不要粒子（赤血球）をすべて除去するという目的を達成するために、図1（4）の状態にし、そこで遠心分離を停止させることを提案する。 この状態では、赤血球はサイズが大きいため沈降速度が速く、ペレットとしてチューブの底に沈殿するが、細菌細胞はすべて高密度バッファーの中に分散している

ただし、この望ましい状態に到達するためには、いくつかの制約を満たす必要がある。 まず、すべての細菌をバッファに集めるためには、上部（Plane A）から始まった細菌が血液培養ブロス（Medium 1）の層を通ってヒストパック（Medium 2）へ移動するのに十分な時間を確保する必要があります。 数学的には、これは次のことを意味する：

ここで、tは遠心分離プロセスを実行する時間、l1は血液培養ブロスのカラムの長さ、vb1はこの層における細菌の沈降速度である。 この時点（Plane Aから出発した細菌がPlane Bを越えてバッファに入ったところ）を図1（2）に描いている。

この状態のもう一つの顕著な特徴は、細菌と赤血球がこの時間までにバッファーの中で明確な「バンド」を形成しないかもしれないことである。 任意の水平面から出発した赤血球は、同様の位置にあるバクテリアよりもさらに移動するが、平面Aから出発した赤血球は、平面B（2液間の界面）から出発したバクテリアを追い越さないかもしれない。 このようなことが起こり、赤血球とバクテリアが緩衝液中で異なるバンドを形成するためには、緩衝液のカラムが十分に長くなければならない。 例えば、図1(2)の破線で示した深さまでしか緩衝液柱が伸びていないと、はっきりとした帯を形成することはできない。 数学的には、Plane Aから始まる赤血球（沈降速度が速い粒子）がPlane Bから始まるバクテリア（沈降速度が遅い粒子）を追い越すという条件は、次のように表すことができる。

ここで、l1及びl2はそれぞれ血液培養ブロス（培地1）及び緩衝液（培地2）の列の長さ、vR1及びvR2はそれぞれブロスと緩衝液における赤血球の沈降速度、vb2は緩衝液における細菌の沈降速度である。 上記の式は、次のように並べ替えることができる：

さらに、もともと培地1に存在するすべての細菌が培地2に集められることが望ましいだろう。 これは、上部（Plane A）から出発した細菌が2相の界面（Plane B）を通過するまでに、Plane Bから出発した細菌は下部に到達してはならないことを意味する。 数学的には、この条件は次のように表される:

ここで、vb1 は媒体1中のバクテリアの沈降速度である。 式（3）と式（5）を満たす場合、系は図1（4）の状態になり、すべての赤血球がチューブの底に到達して別の層を形成しているが、細菌は一つもそうなっていない。 (このとき、赤血球はすべてチューブの底に到達して別の層を形成しているが、細菌は一つも形成していない（細菌はすべて媒体2にある）。 この状態は、すべての赤血球(面Aから出発したものも含む)がチューブの底に到達したときに初めて起こる。 数学的には、その瞬間（t1）は次のように表される：

バクテリア（最初に界面、すなわち面Bに存在するもの）がチューブの底に達し始めると、この状態は消滅する。 これが起こる時間（t2）は次式で与えられる：

したがって、最良の分離を得るためには、（i）2つの媒体の柱長が式（3）および（5）を満たすようにし、（ii）沈殿工程を実行する時間（tcentrifugation）が次式で与えられるようにする必要がある。

t2より長く遠心分離を続けると、図1（5）のように、一部またはすべての細菌も底に沈殿してしまう状態になる。 目的の菌種を純粋に分離するためには、図1(4)の段階で遠心分離を止め、上層を捨て、底の沈殿物を乱すことなく濃いバッファーを引く必要がある。

このt1とt2の間の「操作ウィンドウ」は、図2に模式的に描かれている。 横軸は遠心分離の時間、縦軸は濃厚緩衝液（培地2）中に存在する赤血球とバクテリア粒子の割合を示している。 両者とも、最初は上層から移動してくるにつれて割合が上昇し、密なバッファーの中を帯状に移動するにつれて一定時間が経過し、最後に底に沈むにつれて減少している。 移動速度の速い赤血球ほど、上昇/下降の勾配が急であり、また、すべての赤血球が高密度バッファに存在する期間も短くなる。

赤血球と細菌の沈降速度（式3、5、8で与えられる制約の数値を決定する）は、それぞれの形状、サイズ、密度に基づいて予測することができる。 の沈降速度は、式：

によって与えられる（17）ここで、ρおよびρlはそれぞれ粒子および液体の密度、μは液体の粘度、Rは粒子の有効半径、gは重力／遠心分離のため加速度である。 大腸菌は棒状の細菌で、長さ2ミクロン、直径0.5ミクロンである(18)。 大腸菌は棒状の細菌で、長さ2ミクロン、直径0.5ミクロン(18)であり、その有効沈降半径(R)は次のように与えられる(19)。 したがって大腸菌の場合、a=1ミクロン、b=0.25ミクロンである。 これらの値から、大腸菌の沈降速度は上層液を26.7ミクロン/秒、ヒストパック1083を6.56ミクロン/秒と予想する。

一方、人間の赤血球は直径7〜8ミクロン、厚さ2ミクロンの両凹の円板である(20)。 したがって、それらは有効沈降半径が以下のように与えられる(19)楕円球としてモデル化できる：

ここで、aおよびbはそれぞれ長軸と短軸の半分の長さである。 aを4ミクロン、bを1ミクロンとすると、我々の装置であるEppendorf-5804を用いて相対遠心力400×gで遠心分離にかけると、赤血球は密度∼1.の最上層を500ミクロン/秒の速度で沈降すると予測される。02g/mL（当社測定）、Histopaque（密度＝1.083g/mL）を通過すると101ミクロン/秒となる。

粒子の沈降速度は、粒子-粒子相互作用を考慮することでより正確に予測することが可能である。 これらの粒子-粒子相互作用は、沈降粒子によって上方に変位した液体が、最初の粒子のすぐ後ろまたは横にある他の粒子に衝突し、後者に増加した流体抗力を与え、それによってグループとしての粒子の有効（平均）沈降速度を低下させるときに生じます。 この現象は「沈降の妨げ」と呼ばれ、粒子の体積分率が無視できない場合は、これを考慮する必要があります。 沈降を妨げる系の有効沈降速度の計算には、多くの半解析的あるいは経験的な式が利用可能です(21)。 そのようなアプローチの1つがRichardson-Zaki Correlationで、有効沈降速度(v′)は次式で与えられる。

ここで、vは非妨害の場合の粒子の沈降速度、φは粒子の体積分率である。 血液は通常1:4で血液培養ブロスに希釈される(22)。 ヘマトクリット（血液中の赤血球の体積分率）は通常0.4～0.45程度であるため（23）、結果として試料中の赤血球の体積分率は0.1程度となる。 このことを式12を用いて考慮すると、培地1および培地2中の赤血球の予測沈降速度は、それぞれ307ミクロン/秒および62ミクロン/秒となる。 また、血液培養が陽性になる時点では、懸濁液1mLあたり約108CFU（colony forming units）（細胞）の細菌が含まれている(24)。 しかし、その大きさ（半径〜1ミクロン）が小さいため、体積率は0.001以下にとどまり、「沈降を妨げる」効果は無視することができる。

目的の細胞を分離したいサンプル量があれば、補足資料（補足図1）にあるフローチャートを用いて、沈殿バッファーの選択、当該バッファーの目的細胞の沈降速度の予測、使用する適切な容量（遠心分離チューブのコラム長）の決定、最終的には使用できる遠心分離器を用いた最適な遠心分離時間（操作ウィンドウ）の計算が可能である。 我々のシステム（15mlの遠心管に5mlの「陽性」血液培養ブロスを充填）の場合、そのプロセスは表1に要約される。 最小カラム長および最小/最大動作時間の理論的予測。

Experimental Validation

最初に、BACTEC Ped-Plus培地（Becton Dickinson, Sparks, MD）8mlに分散させた合成「陽性血液培養ブロス」、新鮮血液（ボランティアから採取）2ml、および、0.mLの大腸菌K-12のCFU（細胞）を含む懸濁液1mlを加え、37℃で一晩（12〜14時間）ヌーティングミキサー上で培養し、∼109赤血球／mLおよび108CFU／mLの細菌を含む懸濁液を得た。 このブロス1.5mLをマイクロ遠心管（Eppendorf, New York, USA）に取り、遠心分離によって細胞を「ペレット化」した。 上清を回収し、天秤（OHaus® GA-110）を用いて1mlの質量を測定し、ブロス中の液体の密度を推定した。

さらに、陽性血液培養ブロス5mLを5mL Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA) に浸した。 このような複数のチューブをEppendorf-5804ベンチトップ型遠心分離機に装填し、時間を変えて遠心分離した（1分、3分、6分、10分、15分、30分、50分、70分、および90分）。 遠心分離終了後、チューブを静かに取り出し、上層（血液培養ブロス）を廃棄し、底部の沈殿物（存在する場合）を乱すことなくヒストパック層を回収した。 採取した液体中の細菌濃度は、連続希釈、Tryptic Soy Agarへのプレーティング、培養、コロニーカウントを含む標準的な方法で測定された(25)。 赤血球の濃度は、サンプルのアリコートを顕微鏡下でヘモサイトメーターで調べることによって得られた(26)。

結果と考察

結果は図3にまとめられている。 線は、我々の理論的予測に基づき、ヒストパック層（底の沈殿物を除く）に存在すると予想される血球またはバクテリアの理論的数を表している。 実線の記号は、赤血球（四角）および大腸菌（菱形）の数の少なくとも3回の観測値の平均を表している。 エラーバーは標準偏差。

図3に見られるように、観察された挙動は、定性的に我々の予測と一致する。高密度粒子（赤血球および細菌）の両方について、ヒストパック内の濃度は、最初は時間とともに上昇し、ある時間にわたって一定で、最後に減少した。 しかし、赤血球の場合、すべてのプロセス（上昇、定常状態、下降）が予測よりもわずかに遅くなることがわかった。 この沈降速度のわずかな低下の影響は、幸いにも、動作ウィンドウの始まりがすべての細菌が高密度バッファに入るのに必要な時間によって支配されているため、動作ウィンドウには影響しません。 それが起こる頃には、高密度バッファーの赤血球の濃度は無視できるほどになっている。 言い換えれば、我々のモデルによって予測された動作ウィンドウ（約20分から約75分）が維持されていることがわかる。

一般的に発生するほとんどの細菌もかなり小さく（特性長で約1ミクロン）、その密度は同程度である。 (例えば、Pseudomonasは1.1 g/mL (27); Streptococcusは1.13 g/mL (28), Bacillusは1.135 g/mL (29))である。 したがって、血液培養ブロスと Histopaque-1083 のいずれにおいても大腸菌と同程度の沈降速度であると考えられ、その結果、操作ウィンドウも同程度となるはずである。 しかし、この理論的解析は、異なるハードウェアを用いた陽性血液培養ブロスからの細菌の分離だけでなく、高密度バッファーを用いた異なるマトリックスからの他の標的細胞の分離のためにも、他の動作ウィンドウを予測する根拠を提供するものである。 また、この方法は、沈降の速い種と遅い種の両方を含む混合物から標的を分離するために逐次的に使用することもできる。 このような場合、まず我々の方法を用いて、動きの速い種をすべて除去し、その後、残りの混合物中の最も沈降の速い種の標的を回収するために用いることになる。