LADD Multiple Stainを用いたin vitro筋芽細胞融合の解析と定量化

Adult skeletal muscle tissue contains a population of precursor cells, known as satellite cells, that are responsible for skeletal muscle repair (1-3).The grown system is in vitro miblast fusion using the LADD Multiple Stain, a automation of the system is in v…The system is in v..The information is in vitro. 活性化した衛星細胞（筋芽細胞）は筋損傷部位に移動し、そこで増殖、分化、融合して多核筋管になる(3-5)。 このプロセスの最終的な成功は、常駐する筋芽細胞が終末分化の際にどの程度融合したかで測られる。

in vitroでの筋芽細胞融合を実験的に評価するために、顕微鏡による免疫蛍光の検出に基づいて融合指数を算出する。 ミオシン重鎖（MyHC）やデスミンなどの筋繊維構造タンパク質の検出には蛍光標識抗体を、またF-アクチンの可視化には蛍光標識ファロイジンを用いることができる（6-9）。 核は、Hoechst 33258のようなDNA結合化合物を用いて蛍光標識する。 その後、核が≦3個の筋細胞における核の割合（9）またはMyHC陽性の筋管における核の割合（10）のいずれかが計算される。 これらのアプローチはよく確立されている。しかし、目的の抗原に対して強く特異的なシグナルを生成し、その後の融合解析を行うには、広範囲で時間のかかる最適化が必要である。 蛍光標識抗体を使用する場合、蛍光顕微鏡の利用が追加要件となり、すべての施設で利用できるわけではありません。 その後の定量化では、集団を代表する融合指標を得るために、多数の視野を手間と時間をかけて分析する必要がある。 これらの制限と、抗体ベースのアッセイの比較的高価なことから、我々は、広く入手可能なLADD Multiple Stainを用いた筋芽細胞融合の定量化のための迅速でコスト効率のよいin vitroアッセイを開発することになった。 我々の研究では、新鮮なLADDは、0.365gのトルイジンブルー（Cat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO）と0.135gのフクシン（Cat. #47860-25G; Sigma- Aldrich）を最終容量の50mlの30％エタノールに含むように準備される。 この溶液を溶解するまで混合し、Whatman (number 4) filter paper (Cat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) で濾過した後、30%エタノールに溶解する。 LADD染色液はプラスチックまたはガラス容器に入れ、室温で保存でき、再利用できる。 染色する細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、70％エタノールで10分間固定する。 エタノールを除去し、500 µL LADD stainを加え、細胞が完全に覆われるようにする。 細胞を1分間インキュベートした後、染色剤を除去し、LADDが水中に溶出しなくなるまで蒸留水で繰り返し洗浄する。 その後、細胞を乾燥させ、位相差光学顕微鏡で観察するまで室温で保存する。 観察中の照明を改善するために、染色された細胞をPBSに浸すことができる。

この染色を筋芽細胞融合の可視化にうまく利用できるかどうかを決定するために、C2C12細胞を標準培養条件（12）で80％コンフルエンス（図1A）まで増殖させた。 その後、培地を2%の馬血清を含む分化培地に変更したところ、筋管に融合した（図1B）。 分化の成功は、未分化細胞（図1C）と比較してMyHC（図1D）の発現が増加することで確認された。 LADD染色後、未分化C2C12筋芽細胞は薄紫色の細胞質と黒っぽい核を示す（図1E；矢印）。 しかし、分化後は、筋管細胞質は暗紫色に見え（図1F；矢頭）、より明るい核が多核細胞内にはっきりと見える（図1F；矢印）。 したがって、LADD Multiple Stainに続いて、明確に定義された核が観察され、免疫細胞化学（図1D）に続いて蛍光顕微鏡を使用して見たように、多核筋管の細胞質（図1F）から容易に区別される＜8234＞。 多核筋繊維の可視化。

C2C12筋芽細胞は分化培地で5日間培養された。 細胞は分化0日目（D0）と5日目（D5）に評価された。 D0の未染色筋芽細胞（A）とD5の筋管（B）の位相差光学顕微鏡画像。 ミオシン重鎖（MyHC）（緑）を標識し、核（青）を可視化するためにヘキスト33258で共染色したD0の筋芽細胞（C）およびD5の筋管（D）の共焦点顕微鏡画像。 MyHCは、マウスモノクローナルMF20一次抗体（1：200希釈）（Developmental Studies Hybridoma Bank）、DyLight 488コンジュゲートAffiniPure donkey anti-mouse lgG二次抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）を用いて検出された。 D0におけるLADD染色した筋芽細胞（E）およびD5における筋管（F）の位相差顕微鏡画像；矢印は核を示し、矢頭は細胞質染色を示す。 スケールバー＝20μm。

画像解析を用いて筋芽細胞融合の進行状況を測定できるかどうかを調べるために、C2C12細胞を6日間分化させ、LADD染色した細胞の画像をオリンパスCKX41倒立光学顕微鏡（日本、東京）で200倍で撮像した。 予想通り、融合筋細胞および筋管の数は、その後の分化の各日において明らかに増加した（図2A）。 そこで、融合指数を算出したところ、分化した筋芽細胞は、0.45%（1日目）から31.4%（6日目）へと段階的に融合指数が上昇することが確認された（図2B）。 このようにして得られた融合指数は、標準的な免疫細胞化学（MyHCを検出するため）および核染色を用いて算出された指数と良好に比較される（13）。 ImageJ解析ソフトウェア（https://imagej.nih.gov/ij/）が（融合の指標として）筋繊維面積を定量化するのに適応できるかどうかを決定するために、マクロを開発し、図2Aで表される画像上でテストした。 マクロは以下のように設定され、そして保存される：

• ImageJを開き、「プラグイン＝>マクロ＝>スタートアップマクロ」

• 既存のテキストを補足表S1に示したコーディングに置き換えます。

画像をImageJで開き、”Macros = > Run Macro “でマクロを実行する。 これで、1枚ずつ画像が解析される。 筋繊維の部分のみを解析するため、閾値が正しく設定されていることを確認する必要があります。 色のしきい値は、マクロの行「setThreshold(0,130)」を編集することで変更可能で、2番目の数字を大きくすると、より薄汚れた部分が含まれ、逆に小さくすると、より多くの部分が排除される。 この方法により、筋繊維面積は6日目に29.6%に達し（図2C）、同時点で計算した融合指数（図2B）とよく比較された。 Jenner色素やGiemsa色素も、LADDとほぼ同様に光学顕微鏡用の筋管染色に使用できるが、LADDによる染色は何倍も速く、我々が開発したImageJマクロにより、どの面積を測定するか、より詳細に制御することができる（14）。

LADD Multiple Stainの融合解析への使用をさらに検証するために、C2C12細胞を10 µM BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) の存在下または不在下で5日間分化させ、続いて前述のように固定しLADDで染色した。 BB94は市販の合成マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤であり、筋芽細胞融合を減少させることが以前から示されている(15,16)。 BB94の存在下では、融合指数は50％（DMSOコントロール）から22％（P < 0.05）へと有意に減少した（図2D）；筋線維面積の分析でも同じ傾向が見られ、融合は46％（DMSOコントロール）から21％（P < 0.05）と減少していた。BB94の存在下で（図2E）。

ここでは、LADD Multiple Stainを使用して筋線維構造と関連する筋核の両方を染色する迅速で新しい方法を紹介します。 その後、ImageJを用いて、融合の指標として筋繊維の面積を正確に評価する。 LADDは比較的安価で、処理と解析に要する時間が大幅に短縮されたため、免疫細胞化学や蛍光顕微鏡を必要とせず、標準的な研究室で融合が迅速に解析できるようになったことを意味する。 C.S.は知的インプットと関係する学生への監督を行い、また複数の原稿の修正に貢献した。 C.N.は関与した学生およびポスドクに知的インプットと監督を行い、プロジェクトの資金を提供し、論文の複数の草稿の修正に貢献した

.