E． coli expression
組換えタンパク質を生成するには、発現宿主を使用する必要があり、大腸菌は通常この目的のための最有力候補である。 大腸菌は、遺伝学的に単純で、培養が容易で、発現が速く、収量が多いという魅力的な宿主である一方、効率的な翻訳後機械がなく、コドン使用法に偏りがあり、高分子量タンパク質の生産が難しいという欠点がある。 しかし、大腸菌による発現の最大の弊害は不溶性発現であり、組換え体の過剰発現により、封入体と呼ばれる不溶性のタンパク質凝集体が形成される現象である。
封入体への対処とターゲットタンパク質の溶解性を改善する方法
封入体が形成されると、科学者は通常、可溶性タンパク質を回収するためにin vitroタンパク質可溶化およびリフォールディングという面倒なプロセスを試すか、不溶性の問題を防ぐためにプロセスレベルまたは分子レベルでの発現最適化を行っています。 例えば、発現条件の最適化、成長・誘導条件の調整、培地やバッファーの変更など。 代替案としては、分子的なアプローチを試み、トランケーションを作ったり、特定のアミノ酸を変異させてタンパク質をより可溶性にするなど、配列内の望ましくない要素を排除してターゲットタンパク質を操作することが考えられます。 また、構造情報に基づいた合理的な部位特異的突然変異誘発のアプローチを採用することもできますし、定向進化のアプローチをとって、ランダムな点変異体、欠失、断片の溶解性をスクリーニングすることもできます。 8332>
Fusion partner approach to improve protein solubility
この方法を用いると、発現が困難なタンパク質やペプチドを、別の安定で溶解性の高いタンパク質と融合させて、その融合タンパク質が発現を促進させるという考えで、安定化させることができる。 多くのタンパク質が高可溶性であるが、タンパク質可溶性向上剤としての効果は皆無である。 この点、Maltose Binding Proteinは、タンパク質の溶解性を高めるパートナーとして非常に有用である。 大腸菌のMBPタグは、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）やチオレドキシン（TRx）タンパク質よりも有効なタンパク質可溶性向上剤であることが証明されています。
Figure 1: GenScript Scientist recommendation regarding construct design
About the MBP tag and its mechanism of action
MBP は malE 遺伝子によってコードされている大腸菌の約 42 kDa 天然タンパク質で、糖質であるマルトデキストリンを取り込み、分解、輸送する役割を担っている。 もともとは1980年代にタンパク質発現タグとして開発され、下流で融合した様々な標的タンパク質の溶解度を著しく高めることが知られている。 MBPタグによるタンパク質の溶解性向上の正確なメカニズムは不明であるが、タンパク質合成時および合成後の下流のパッセンジャータンパク質を安定化させ、タンパク質分解から保護することが知られている。 また、MBP融合タンパク質の細胞質収量は、融合タンパク質が効率的な翻訳開始のための信頼できるコンテキストを提供するため、通常より高くなります。 MBPタグは、その表面の溶媒にさらされたホットスポットを介して相互作用することにより、シャペロンとして働き、そうでなければ不溶性のパッセンジャー蛋白質を安定化させるという説もある
MBPタグの使用
N末端またはC末端に融合したMBPタグは、組換え可溶性発現量を増やすことが示されているが、一般にはN末端に融合されることが多いようである。 残念ながら、全ての用途に理想的なタグは存在しないため、タグの汎用性や下流への応用を高めるために、様々なニーズに対応したコンビナトリアルタグ化法が開発されている。 2つのアフィニティタグをタンデムに発現させ、プロテアーゼ切断部位をターゲットタンパク質の前に置くことで、複数の精製方法を使用することが可能になる。 溶解性を高めるタグと精製用タグを組み合わせることで、タンパク質の溶解性や発現量を向上させ、効率的な精製方法を実現した
図2：コンストラクト設計戦略の一般図-N末端にアフィニティ・溶解性タグ、次にタンパク質分解用切断サイト、そしてターゲットタンパク質を組み合わせることにより、特に不溶性のターゲットタンパク質に対して良い結果を与えることができます。 リンカーシークエンスは、タンパク質分解性切断の問題を解決するのに役立つことが多い。
Purification of MBP-tagged proteins
タンパク質の溶解性向上以外に、MBP-fusion戦略を用いる利点として、下流の標的タンパク質の精製を容易にすることが挙げられます。 MBPはアミロース樹脂に結合する天然のアフィニティタグであり、架橋アミロースと結合することで1ステップのアフィニティ精製に利用することが可能である。 アミロースと結合したMBPタグ融合リコンビナントタンパク質は、通常、マルトースを用いた非変性条件下で溶出されます。
この戦略の欠点
- MBPタグの立体障害により、標的タンパク質の切断が問題になることがある
- アミロース樹脂は壊れやすく、比較的高価である
- 切断後の標的タンパク質沈殿
- 一部のMBP融合タンパク質はアミロース樹脂に効率よく結合しないし、結合した場合でも、アミロース樹脂に溶け込まない。
Conclusion
E.S.A.における不溶性の問題に対する単純でグローバルな解決策はないが、そのような問題を解決するための方法を提供する。大腸菌発現における不溶性の問題を解決するための単純でグローバルなソリューションはありませんが、よく設計されたコンストラクトと慎重に作成された発現戦略により、目的の可溶性タンパク質を得ることができます。 MBPは組換え可溶性タンパク質生産において信頼できる可溶性タグであり、可溶性はタンパク質生産キャンペーンにおいて最も重要な要素の一つであるが、最終目標は常に可溶性であるべきではない。 発現レベル、タンパク質活性、純度、均質性、安定性はすべて、組換えタンパク質生産キャンペーンに着手する前に考慮しなければならない重要な要素である。
MBPタグの有用性を示す文献は少ない
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Production of Fusokines using MBP -Maltose-
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