Mechanisms of resistance to fluoroquinolones and carbapenems in Pseudomonas putida

Abstract

目的：Pseudomonas putidaは、フルオロキノロン系およびカルバペネム系に対する耐性を示す。 Pseudomonas putidaは通常，抗菌薬に感受性を示すまれな日和見感染症である。 P. putidaの臨床分離株における抗菌薬耐性に関するデータは限られている。 尿路感染症患者から分離されたP. putidaのフルオロキノロン系抗菌薬，カルバペネム系抗菌薬およびその他の抗菌薬に対する感受性の特徴を検討した。 フルオロキノロン系およびカルバペネム系抗生物質耐性は，PCR法およびDNAシークエンシング法により遺伝学的に解析した． 外膜蛋白質（OMP）プロファイルはSDS-PAGEにより解析した。 5株中4株がフルオロキノロン系抗菌薬とカルバペネム系抗菌薬に耐性または中間抵抗性を示した。 キノロン耐性決定領域の塩基配列から，GyrAのThr-83→IleやGyrBのGlu-469→Aspなどのアミノ酸変異がフルオロキノロン薬に対する高い耐性に寄与している可能性が示唆された． カルバペネム系薬に耐性を示したメタロ-β-ラクタマーゼ産生菌4株は，IMP型メタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子を保有していた。 46 kDa OMPの産生低下とメタロ-β-ラクタマーゼ産生の複合作用が，カルバペネム系薬の最高MICを示したP. putida分離株で示された

結論 P. putidaのフルオロキノロン系抗菌薬およびカルバペネム系抗菌薬に対する耐性機構を明らかにした．

はじめに

Pseudomonas putidaは非発酵性のグラム陰性桿菌で、新生児、好中球減少症、癌患者の菌血症や敗血症、尿路感染症（UTI）などを引き起こす日和見性のヒト病原体である1-4。

ほとんどのP. putidaはカルバペネム系、フルオロキノロン系、アミノグリコシド系などの抗菌薬に感受性がありますが、カルバペネムを含むβ-ラクタムに耐性を示すメタロβ-ラクタマーゼを生成する臨床分離P. putidaが報告されています3、4、8、9。 さらに、β-ラクタム系に加え、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、トブラマイシンに耐性を示すメタロ-β-ラクタマーゼ産生株が最近報告された3。 P. putidaの薬剤耐性は，メタロβ-ラクタマーゼの産生や排出系の特徴から検討されている3,4,8．-10-12 緑膿菌は治療中に急速に耐性を獲得する能力を持つが13 、P. putidaが同じ能力を持つかどうかは不明である。 P.putidaの抗菌薬耐性化については不明であるが，耐性化リスクを評価するためには，臨床分離されたP. putidaの抗菌薬耐性に関する豊富なデータが必要である。 今回，当院で1年間に尿路結石の原因菌として分離されたP. putidaのフルオロキノロン系およびカルバペネム系抗菌薬に対する感受性を測定し，耐性機序を明らかにした。 8706>

菌株と微生物学的方法

本研究で使用した菌株は，異なる患者から原因菌として分離されたP. putidaの臨床分離株5株であった。 同定は当院臨床微生物検査室における標準的な生化学的検査により行った。 分離株はすべて尿から得られたものである． これら5株の染色体DNAのSpeI制限断片パターンは様々であった（図1）。 菌は20%グリセロールを含む心筋梗塞用ブロス（日水製薬，東京，日本）中で-70℃にて保存した． その後，菌体を心筋梗塞用寒天培地（日水製薬）に接種し，37°Cで一晩静置培養した。 MICはClinical and Laboratory Standards Institute（CLSI），旧NCCLS（National Committee for Clinical Laboratory Standards）に準拠した寒天希釈法で測定した14。感受性試験はMueller-Hinton寒天（日本ベクトン・ディッキンソン，東京，日本）により製造元の指示に従い実施した。 ceftazidime，imipenem，meropenem，norfloxacin，levofloxacin，gatifloxacin，gentamicin，amikacinおよびminocyclineのMIC解釈基準はCLSI/NCCLSのそれに従った。14 その他の抗菌薬のMICブレイクポイントは定義されていない．

抗菌薬

キノロン耐性決定領域の増幅とDNA配列決定

染色体DNAは、既報のようにP. putida分離株から抽出した。15 PCR増幅には、特定のプライマーセットを用いて行った。 5′-gacggcctgaagccggtgcac-3′ と 5′-gccacggcgataccgctgga-3′ のプライマーセットにより、gyrA遺伝子の115位から531位のキノロン耐性決定領域（QRDRs）417bp断片を増幅させた。16 5′-agtacttcgccgacttcct-3′と5′-tacaggcgcgacaggcgctt-3′のプライマーセットにより、1073位から1811位のgyrB遺伝子のQRDRの739bpの断片が増幅されることが判明した。17 5′-tctacgccatgagcgaactgg-3′と5′-agcacctcggaatagcg-3′のプライマーセットは、158位から419位の262bpのparC遺伝子のQRDRを増幅した18。増幅はAdvantage-GC2酵素 (BD Biosciences Clontech Japan, Tokyo, Japan) でメーカー指示書に従い実施された。 QRDRの塩基配列は、AmpliTaq DNA polymerase (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) とBigDye terminator v3.0 Taq cycle sequencing ready reaction kit、自動DNA配列決定システム (ABI PRISM 310 genetic analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) で決定されました。

メタロβラクタマーゼ遺伝子の検出

外膜タンパク質の調製

外膜タンパク質（OMP）は、以前に記載したように調製した21。 8706>

結果

感受性

フルオロキノロン系とカルバペネム系の感受性試験の結果をそれぞれ表1、表2にまとめた。 β-ラクタム系薬のMICは，ampicillinとcefaloridineが＜2810＞128 mg/L，ceftazidimeが2～＜2810＞128 mg/L，imipenemが1～128 mg/L，panipenemが0.5～＜2810＞128 mg/L，meropenemが4～＜2810＞128 mg/L，biapenemは1～＜2810＞128 mg/Lであった。 アミノ配糖体およびミノサイクリンのMIC範囲は，以下のとおりであった。 gentamicinは0.25～8 mg/L，amikacinは0.5～8 mg/L，kanamycinは0.5～1 mg/L，minocyclineは4～64 mg/Lであった。 4株はフルオロキノロン系薬とカルバペネム系薬の両方に耐性または中間型を示し，1株HU2001-429はβ-ラクタム系薬とフルオロキノロン系薬の両方に感受性を示した． P. putidaの3株（HU2001-412，HU2001-419，HU2001-451）は，ceftazidime，imipenem，meropenemなど調べたすべてのβ-lactam系抗菌薬に耐性を示した． HU2001-412，HU2001-419，HU2002-467の3株は，norfloxacin，levofloxacin，sparfloxacin，gatifloxacin，pazufloxacinなど高いフルオロキノロン耐性（＜2810＞128 mg/L）と，minocycline耐性（32～64 mg/L）を示した。 また，5分離株においてsitafloxacinのMIC範囲は≦0.125～8 mg/Lであった。

フルオロキノロン耐性

カルバペネム耐性

P. putida 5株のうち，カルバペネム耐性の4株はIMP型メタロβラクタマーゼ遺伝子を持っていたが，VIM型メタロβラクタマーゼ遺伝子はPCRで検出されなかった（表2）． IMP型メタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子を有するP. putidaにおけるカルバペネム系薬のMIC範囲は以下の通りであった。 imipenemは8～128 mg/L，panipenemは32～＜2810＞128 mg/L，meropenemは128 mg/L以上，biapenemは32～＜2810＞128 mg/Lと，いずれも高いMIC範囲であった。 5株中最も高いカルバペネム系抗生物質のMICを示したP. putida HU2001-451では，46 kDa OMPの産生はSDS-PAGEで検出できなかったが，P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429, HU2002-467からは同様に検出された（Table 2）。

討論

今回，急性，反復，慢性尿路結石患者から分離されたP. putidaの5株のフルオロキノロンおよびカルバペネムに対する感受性の特徴を明らかにした． 5株とも異なるPFGE遺伝子型を示したことから，これらのP. putidaによる感染症はいずれも院内感染ではないことが示唆された． 5株中4株はフルオロキノロン系抗菌薬およびカルバペネム系抗菌薬に対して耐性または中等度であった． 3株はsitafloxacinを除くすべてのフルオロキノロン系抗菌薬に高度耐性（>128 mg/L）であった． 本研究で検討したフルオロキノロン系抗菌薬のうち，sitafloxacinはP. putida分離株に対して優れた抗菌力を示した。 また，フルオロキノロン系抗菌薬に高い耐性を示す菌株は，カルバペネム系抗菌薬およびミノサイクリン系抗菌薬にも耐性を示した。 緑膿菌のフルオロキノロン耐性は，GyrAやParCのQRDRの変異によるDNAジャイレースやトポイソメラーゼIVのアミノ酸変異が主要機構であるが，GyrBの変異の関与も示唆されている18，22． P. aeruginosaのフルオロキノロン系抗菌薬に対する感受性の低下には、排出系が関与する二次耐性機構が寄与している22,23。本研究では、GyrA、GyrBおよびParCのQRDRにおけるアミノ酸変化を、5株の臨床分離P. putidaで比較検討した。 フルオロキノロン耐性P. putidaは、GyrAにThr-83→Ile、GyrBにGlu-469→Aspといった変異を追加しており、これらはフルオロキノロン耐性P. aeruginosaに見られる変異に対応していた22,23 。 これらの結果は，GyrAのThr-83→IleやGyrBのGlu-469→AspなどのQRDRのアミノ酸変異がフルオロキノロン系薬に対する高い耐性に寄与していることを示しているが，このような菌株に野生型のgyrA，gyrB，parC遺伝子を持つプラスミドを導入することでフルオロキノロンのMICが低下するかどうかは判断されていない24）。 P. putidaの多剤耐性は，TtgABC，MepABC，TtgDEF，ArpABCの排出系が過剰発現していることが報告されているが，本研究では排出系の役割は不明なままであった．a P. putidaのメタロ-β-ラクタマーゼにはIMP型とVIM型があり，3,4,8,9,9a 4名のカルバペネム耐性P. putidaでは，ディスク拡散法によりメタロ-β-ラクタマーゼの生成が検出された（データ未掲示）． これらの菌株はIMP型メタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子を持っていたが，VIM型メタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子はPCRで検出されなかった。 メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌の存在は，β-ラクタム耐性の遺伝子のリザーバーとして臨床上重要な問題である。 緑膿菌のカルバペネム系抗生物質耐性の主なメカニズムは、メタロβ-ラクタマーゼの産生以外に、カルバペネム系抗生物質には作用するが他のβ-ラクタムには作用しないポリン形成膜貫通チャネルOprDの欠損による変異性不透過性がある21,25,26。 OprDの欠損により，緑膿菌はイミペネムに対して耐性を示し，メロペネムに対しては感受性が低下した27。カルバペネム系薬耐性4株中，最も高いMIC（≧128 mg/L）を示したP. putida HU2001-451では，他の分離株と比べて46 kDa OMPの産生が減少している。 P. putida HU2001-451のOMPプロファイルは，我々の以前の研究でOprDの産生低下が確認されたカルバペネム耐性緑膿菌のプロファイルと類似していた21。 以上の結果から，本菌のカルバペネム耐性は46 kDa OMPの産生低下とメタロ-β-ラクタマーゼの産生低下が複合的に作用していると考えられたが，他のβ-ラクタマーゼがカルバペネム耐性に関係しているかは不明であった。 その結果，GyrAのThr-83→IleやGyrBのGlu-469→AspなどのQRDRのアミノ酸変異がP. putidaのフルオロキノロン系薬に対する高い耐性に寄与している可能性が示唆された． カルバペネム系薬に耐性を示したメタロ-β-ラクタマーゼ産生菌4株は，IMP型メタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子を保有していた。 その結果，46 kDa OMPの産生低下とメタロ-β-ラクタマーゼの産生が複合的に作用し，カルバペネム系薬に最も高いMICを示すP. putidaのカルバペネム耐性を増強することを見出した。

PFGE解析についてミロクメディカルラボ（長野県佐久市）に感謝する． T. H. は文部科学省科学研究費補助金（17790353）の支援を受けている。