Animals
C57BL/6J動物はJackson Laboratory, Slac Laboratory Animal（上海）から購入し自家繁殖させた． Esr1-2a-Cre（Esr1Cre、#017913）およびVglut2-Ires-Cre（Vglut2Cre、#012569）は、Jackson Laboratoryから購入した。 Vgat-Cre (VgatCre)系統は以前に作製した68。 すべてのCre系統は、少なくとも1世代はC57BL/6Jバックグラウンドに交配された。 動物は神経科学研究所の動物施設において、12時間：12時間の明暗サイクルで、餌と水を自由に摂取できるように飼育された。 Cre対立遺伝子のヘテロ接合体動物のみを研究に使用した。 すべての実験プロトコルは、中国、上海の中国科学院神経科学研究所の動物ケアおよび使用委員会（IACUC番号NA-016-2016）によって承認された。
手術
2〜4ヶ月齢の成体マウスをイソフルランで麻酔し（0.8〜5%）、定位フレームに設置した（デビッドコップフインストルメント、Model 1900）。 脱水を防ぐために眼科用軟膏を塗布した。 頭蓋骨を小切開して露出させ、ガラスピペット（先端の直径15-25μm）でウイルスを注入し、光ファイバーを埋め込むための穴をあけた。 mPOAへのウイルス導入の座標は、AP, -0.16 mm; ML, ±0.4 mm; DV, -5.150 mm（PaxiosおよびFranklin mouse brain atlas, 2nd edition）であった。 自家製ナノリットル注入器を用いて70nl/minの流速で、または油圧ポンプ（Harvard Apparatus）を用いて40nl/minの流速で、片側あたり100〜400nlのウイルスを注入した。 ガラスピペットは注入後、約10分間そのままにしてから引き戻した。 モノ光ファイバー（直径200μm、N.A.、0.37、長さ6mm、AniLab Software and Instruments Co, Ltd）またはデュアル光ファイバー（DFC_200/245-0.37_6.0mm_DF0.9_FLT、Doric Lense）は光遺伝学実験ではウイルス注入部位より400μm、光ファイバ計測記録では50μm上に設置した。 光ファイバーは歯科用セメントと頭蓋骨のネジで固定した。 同腹子を無作為に選び、実験用または対照用ウイルスを注入した。 去勢手術は、ケタミン（80mg kg-1）およびキシラジン（8mg kg-1）の腹腔内（i.p.）注射で動物を麻酔して実施された。 動物は、その後の行動試験の前に、手術後3〜4週間回復させた。
ウイルス
行動アッセイ
すべての行動試験は、暗黒サイクルの開始後少なくとも30分で開始し、赤外線カメラを使用してフレームレート25Hzで記録し、関与する動物の遺伝子型、グループ情報、または光刺激状態に対してブラインドされた実験者によって採点された。 光遺伝学的阻害実験に用いた動物を除き、行動試験を行った動物はすべて、試験前はナイーブな処女マウスであった。 光遺伝学的阻害実験では、すべての雄マウスは雌マウスと同居させ、一部は試験前に父親となったが、一部の雌マウスは試験前に子犬と同居させたり、交配して母親としたり、数週間のテストステロン注射を行ったりした。
交尾行動試験では、ホルモンでプライミングした卵巣摘出C57BL/6雌をホームケージに導入し、30分間ビデオ撮影を行った。 交尾行動試験は、少なくとも3日間の間隔をあけて、異なる刺激動物で3回繰り返した。 親としての行動は、P1からP4までの3頭の仔を巣から離れた端に散布し、15分間ビデオ撮影を行い、2-3回繰り返した。
動画は、既報のようにMATLABプログラムを用いてフレーム単位で手動でアノテーションを行った8. 行動は以下の基準に従ってスコア化された：被検動物によって開始された鼻と顔、鼻と体、または鼻と生殖器の接触は「社会調査」としてまとめてスコア化され、そのうち鼻と生殖器の接触は特に「化学調査」（「嗅覚」としても知られている）として定義される。 “マウント “は、実験動物が前肢を刺激物の背中に乗せ、上に登って骨盤を動かしたときに得点化される。 マウント後のリズミカルな骨盤の動きは “Pelvic thrust “として採点されます。 雄の侵入者に対して居住者が開始した突進、噛みつき、転倒などの行動は “攻撃 “として採点されます。 動物が鼻や口で子犬に接触した場合、”子犬接触 “と採点されます。 「仔ガメの回収」は、動物が仔ガメを口で押さえ、通常巣に向かって移動した場合に採点されます。 「しゃがみ込み」は、動物が背中を丸め、巣の中の仔ガメの上でホバリングした場合に採点。 行動実験後の仔ガメは、傷の可能性がないか常に検査した。 行動試行の約2％が傷害を負った仔鯨であった。 これらの試行を除外しても、結論に影響はなかった
光遺伝学的活性化
光遺伝学的実験に用いた動物は集団飼育された。 行動実験当日は、新鮮なケージに導入された。 動物に埋め込んだ光ファイバーに473nmのレーザー電源（上海レーザー光学世紀有限公司または長春新工業光電子科技有限公司）を接続するため、外部光ファイバーを使用した。 外部光ファイバーは，動物が自由に行動できるように回転ジョイント（FRJ_1×1_FC_FC，ドリコムレンズ社製）に取り付けた． 被検動物は外部光ファイバを装着したまま，ケージ内を15分間探索させた． その後，カスタムMATLABプログラムを起動し，Master 9 (A.M.P.I.) を制御し，カメラから記録を開始するトリガーを，レーザーに信号を送り，40 Hz 12 mWまたは20 Hz 5 mWの光刺激を90-120秒間隔でランダムに15秒間与えた． レーザー出力は，埋込前に測定した埋込光ファイバの輝度変換効率に応じて各動物ごとに調整し，ファイバ先端から照射される光のパワーを確保した。 レーザー刺激時には、動物単独で運動量試験を行うか、ホルモンのプライミングを行った卵巣摘出雌、C57BL/6雄、P13-P15の若齢ラット、P1-P4の子犬、または子犬と同サイズのゴムブロックを刺激とした。 各アッセイ中、5～12回の刺激を与えた。 各動物について、各刺激による1〜4回のアッセイ（3〜5分間隔）を任意の日に実施した。 すべての行動アッセイ終了後、動物に光刺激（15秒、12mW、40Hz、10回、固定105秒間隔）のトレインを与え、組織分析のために光刺激の1時間後に4％パラホルムアルデヒドで経心的に灌流させた。
繊維光計測
繊維光計測実験に用いた動物は、行動試験の3-7日前に単独で飼育された。 試験当日は、植え込んだ光ファイバーを、外部光ファイバーを介してファイバーフォトメトリー記録装置であるF-scope（Biolink Optics Technology Inc.、北京）に接続した。 F-scopeでは、488nmの励起レーザー（OBIS 488LS; Coherent）がダイクロイックミラー（MD498, Thorlabs）に反射される。 植え込まれた光ファイバーを通して集められた発光信号は，バンドパスフィルター（MF525-39，Thorlabs）で濾過され，光電子増倍管（PMT，R3896，浜松）上に導かれる． 記録中、レーザー出力は埋め込んだ光ファイバーの輝度透過効率に応じて各動物ごとに調整し、ファイバー先端で放出される光が〜30μwになるようにし、PMT電圧ゲインはGCamp6s動物では500v、対照動物では300-350vに設定した。 開始後、F-scopeソフトウェアがトリガー信号を送り、赤外線カメラからのビデオ撮影を開始した。 発光信号は30Hzでローパスフィルターをかけ、Biolink Optics社提供のソフトウェアを用いて、データ収集カード（USB6009、National Instrument）で500Hzでサンプリングした。 ある試行では、まず動物を5分間探索させ、その間にベースライン信号を記録した。 その後、ホルモンを投与した卵巣摘出雌、プラスチック製の偽マウス玩具、P1-P4の仔マウス、仔マウスと同じ大きさのゴムブロックなどの刺激を導入した。 動物が刺激と相互作用し行動するのを15-90分間許可してから刺激を除去し、その後、信号をさらに5分間記録した。 雄マウスは雌と同居させ、性経験を積ませるか、試験前に父親となるようにした。 処女雌マウスはナイーブな動物として雄型交配と母性行動のテストを行った。 母性行動のベースラインが悪い場合は、一晩仔マウスと同居させた後、再度母性行動を調べた。 母性行動試験後、一部の雌にテストステロン（100μg in 50μl sunflower oil, Shanghai Pharm.）を1日おきに約3週間皮下投与し、再度雄型交配試験を行った。 母親として試験された雌は、ウイルス注入後に交尾して自分の仔を産んだ。
行動試験の前に、二重光ファイバーパッチコード（DFP_200/230/900-0.37_1m_DF0.9_2FCM、Doric Lense）を用いて473nmレーザー電源（上海レーザーと光学世紀株式会社または長春新工業光電技術株式会社）を接続し、行動試験の前に、二重光ファイバーを使用し、仔を産んだ。 Ltd.）と動物に植え込んだ二重光ファイバー（DFC_200/245-0.37_6.0mm_DFT, Doric Lense）をロータリージョイント（FRJ 1 × 2i FC-2FC 0.22, Doric Lense）を介して接続して，動物が自由に行動が取れるようにした． 棲息開始から〜10分後，Master 9から送られる信号によりカメラを起動し，MATLABで作成したカスタムプログラムで制御し，行動過程を記録した． 接近後に光を照射するため、交尾行動試験においてはホルモンを投与した卵巣摘出雌の体長1m以内に、母性行動試験においては散乱した仔獣の周囲を少し広くマーキングした仔獣領域内に、試験動物の位置がプログラムによって検出される限り、光（～12mW）を自動的にトリガーして連続照射を実施した。 各試験において、少なくとも2回の点灯試験と2回の無点灯試験を交互に行った。 行動開始後に光を照射するために、実験者が関心行動をリアルタイムで観察した際に、一定の長さ（5秒または10秒）の青色光（～12mW）を手動で照射した。
蛍光免疫染色
動物を10%抱水クロラールで麻酔し、PBSで経心臓灌流した後、氷冷した4%パラホルムアルデヒド（PFA）をPBSに溶かし込んだ。 その後，ビブラトーム（VT1000S，Leica）を用いて，脳を40μmの厚さで切開した． 切片は数組に等分し，染色に供するか，直接マウントした． 脳切片は、AT中の5％ヤギ血清（PBS中の0.1％Tritonおよび2mM MgCl2）で室温で1時間ブロックし、4℃で一晩インキュベートし、AGT（0.5％正常ヤギ血清，0.1% Tritonおよび2 mM MgCl2、PBS中）中で一晩インキュベートした。 翌日，脳切片をAGTで3回（各30分）洗浄し，適切な二次抗体（Alexa Fluor 488 conjugated, 1:1000; Cy3 conjugated, 1:1000, Jackson ImmunoResearch）とともに室温で2時間インキュベートした。脳切片をAT中Neuro Trace (Life Technologies, Cat# N21479, 1:300) またはDAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) により対染色を行った。 AGT、ATおよびPBSで数回洗浄した後、脳切片をスライドグラスにマウントした。
DAB staining
脳切片を蛍光免疫染色実験と同様に調製し、内因性ペルオキシダーゼをブロックするために室温で30分間3％H2O2で前処理し、PBST（0.PBS中の3％トリトンX-100）で2回10分間ずつ洗浄し、PBST中の5％ヤギ血清で室温で2時間ブロックし、PBST中の一次抗c-Fos抗体（Rabbit anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52）とともに4℃にて一晩インキュベートした。 翌日、切片をPBST中で6回、それぞれ10分間洗浄し、ビオチン結合ヤギ抗ラビット二次抗体（Cat#111-065-003、Jackson ImmunoResearch）をPBST中で室温で2時間インキュベートした。 PBSで5分ずつ3回洗浄した後、脳切片を製造元のマニュアルに従ってVECTASTAIN® ABC Reagentで30分間染色した。 PBSで5分間洗浄を2回行った後、脳切片を3,3-diaminobenzidine (Cat# D5637-5G, Sigma) 溶液でニッケル増量しながら目的の染色強度に達するまでインキュベートした。 反応は水道水で切片を洗浄することにより停止した。 脳切片をスライドグラスにマウントし、通常の光学顕微鏡で4倍または10倍の対物レンズで撮影した。
In situ hybridization
in situプローブ生成用のDNAテンプレートは、各対応遺伝子について以下のプライマーセットでクローン化した。 Vgat、5′-gccattcagggcatgttc-3′および5′-agcagcgtgaagacc-3′；Vglut2、5′-atcgactagtccaaatcttacggtgctacctc-3′および5′-atcgctcagtccatttcctgctct-3′；である。 Cre、5′-ccaatttactgaccggtacca-3′及び5′-tatttacagccagcc-3′；GAD1、5′-cattgagatagaggttg-3′及び5′-agagaagcgaaggctact-3′；Galanin、5′-actcactgaccagcc-3′及び5′-ttggcttagttggc-3′を挙げることができる。 アンチセンスRNAプローブは、T7 RNAポリメラーゼ（Promega、Cat＃P207E）およびジゴキシゲニン（DIG）標識ヌクレオチドを用いて転写された。 動物を10％抱水クロラールで麻酔し、DEPC処理PBS（D-PBS）で経心的に灌流し、続いてD-PBS中の氷冷4％パラフォルムアルデヒド（PFA）で灌流した。 その後，ビブラトーム（VT1000S，Leica）を用いて，脳を40μmの厚さで切開した． 脳切片を0.1% tritonを含む2XSSCバッファで30分間洗浄し、0.25%無水酢酸(vol/vol)を含む0.1Mトリエタノールアミン (pH 8.0) で10分間アセチル化、65℃で2時間プレハイブリッド化液で平衡化し、その後、ハイブリッド化バッファで0.5 μg ml-1の特定RNAプローブと65℃で一晩インキュベートした。 翌日、切片をプレハイブリダイゼーション溶液およびプレハイブリッド/TBST（TBS with 0.1% tween-20）でそれぞれ30分間リンスした。 次に、切片をTBSTで2回、TAEで3回、それぞれ5分間ずつ洗浄した。 次に、切片を2％アガロースゲルのウェルに移し、1XTAEで60V、2時間運転して、ハイブリダイズしていないプローブを除去した。 その後、切片をTBSTで2回洗浄し、ヒツジ抗ジゴキシゲニン-AP（1：2000、Roche、Cat# 11093274910）、時には共染色の目的でウサギ抗Esr1抗体（1：3000、Millipore、Cat# 06-935）と共に、4℃、0.5％ブロッキング試薬（Roche、11096176001）中で一晩インキュベートした。 2日目、明視野染色のために切片を洗浄し、NBT (Roche, Cat# 11383213001) と BCIP (Roche, Cat# 11383221001) で37℃、4-10時間染色した。 免疫組織化学と組み合わせた蛍光in situハイブリダイゼーションでは、まず切片を蛍光二次抗体で染色し、次にファーストレッド（HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Cat# 11758888001）で染め、PBS中のDAPI（5 mg ml-1, 1:1000, Sigma）で対比染色をした。 すべての切片は染色後に洗浄し、スライドグラスにマウントした。 画像は、従来の顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、20倍の対物レンズで撮影された。 手順としては、動物にホルモンのプライミングをした卵巣摘出雌または散在した仔との社会的相互作用の5分間のエピソードを、30分間隔で2回させた。 2回目のエピソードの直後に、動物を10%抱水クロラールで麻酔し、DEPC-PBSで経心的に灌流した後、氷冷した4%PFA in PBSで灌流した。 脳を解剖し、4℃で一晩後固定し、DPEC-PBS中の30%スクロースで脱水した。 その後，脳を20 μmの厚さで切り出し，SuperFrost Plus® Slides (Fisher Scientific, Cat. No. 12-550-15) にマウントした。 スライドは大気中で乾燥後、-80℃で保存し、RNAscope® Multiplex Fluorescent Kit v2 User Manual (ACD Bio.)に従って処理した。 c-Fos intron, c-Fos mRNA, Esr1に対するプローブはACD Bio.に注文し、実験に使用した。 画像は共焦点顕微鏡を使用し、60倍の対物レンズで撮影した。
電気生理学的記録
mPOAにChR2-mCherryをコードするAAVを注入したC57BL/6動物またはGtACR1をコードするAAVを注入したEsr1Creマウスをイソフルランで麻酔して、氷冷酸素化（95% O2/5% CO2） 高ショ糖溶液（mMでの組成：2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 sucrose, 26 NaHCO3)で経皮灌流した。 脳を解剖した後、氷冷酸素切断液中でビブラトーム（VT-1200S，Leica）を用いて、mPOAを含む冠状切片を250μmで切断した。 次に脳切片を人工脳脊髄液（ACSF；組成：mM単位で126 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 Na2HPO4, 2 MgSO4, 10 glucose, 26 NaHCO3, 2 CaCl2）中で34℃、少なくとも1時間インキュベートし、室温で記録した。 細胞は蛍光顕微鏡で確認し，赤外微分干渉コントラスト（BX51，Olympus）により可視化した． 全細胞電流クランプ記録は，MultiClamp700BアンプとDigidata 1440A interface (Molecular Devices)を用いて実施した． パッチクランプ電極（5-8 MΩ）に細胞内溶液（組成：120 K-グルコン酸、4 KCl、10 HEPES、10 ホスホクライチンナトリウム、4 Mg-ATP、および 0.3 Na3-GTP, pH:7.3, 265 mOsm）をバックフィリングした。 光遺伝学的活性化のために、X-Cite LED光源（Lumen Dynamics社製）を用いて、40倍の対物レンズを通して青色光（473 nm、10ms幅、14 mw mm-2、40パルス）をスライス上に供給した。 ChR2発現ニューロンのスパイク忠実度は、異なる周波数の活動電位の誘発に成功した光パルスの数を数えることによって測定された。 スパイクフィデリティは5回の刺激で平均化し、プロットした。 光遺伝学的阻害では、GtACR1発現ニューロンの活動電位を電流注入で膜電位-48mWを保持することで誘導し、連続した青色光をスライス上に繰り返し照射した。
Calcium imaging in brain slices
hSynで駆動するChR2コードAAVとGCamp6sコードAAVをC57BL/6動物のmPOAに共投入した。 mPOAを含む急性脳切片は、上記の電気生理学的手順と同様に準備した。 カルシウムイメージングは，20X/0.95-NA XLUMPLFL水浸対物レンズを装着した2光子レーザー走査型顕微鏡（Ultima，Prairie Instruments Inc.）を使用して実施した（Olympus）． チタンサファイアレーザーを940 nmに調整し、525/70 nmエミッションフィルターを通して512 × 512 pixelのサイズの画像を1.2 Hzのフレームレートで取得した。 470nmの光（10msパルス，15秒，8.4mW mm-2）を異なる周波数（10Hz，20Hz，40Hz）でランダムに2分間隔でスライスに照射した． 画像はImageJで解析した。
ホルモンアッセイ
殺傷時に体幹血を採取し、灌流した。 血清が調製された。 ホルモン価はテストステロンELISAキット（DRG Instruments GmbH, Germany, Division of ARG international, Inc, Cat# EIA-1559）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってアッセイした。 サンプルサイズの計算は行わなかった。 スライスで記録された細胞数または染色でカウントされた細胞数、および行動試験と染色に使用された動物数は、同様の実験の公表文献に従って選択された。 事後組織学的解析の結果、事前に設定した基準に従ってミスヒットと判断された動物のデータポイントは、解析から除外した。 GtACR1を注入した雌Esr1Creマウス3匹と雄Esr1Creマウス1匹、Casp3を注入した雌雄VgatCreマウス1匹と雌Esr1Creマウス1匹の計4匹が解析から除外された＜1329＞＜470＞脳切片でのCa2+イメージング実験からのデータを解析するには、画像をイメージJで数値化した。 簡単に言えば、GCaMP6s+細胞の輪郭を手動で描き、相対蛍光変化（ΔF／F）を、式ΔF／F＝（F-F0）／F0により各細胞について計算し、ここでF0は光刺激前の最後の10フレームにおける平均ピクセル強度、Fは光刺激後の最初の6フレームにおける平均ピクセル強度とした。 光刺激期間中に取得された画像は解析から除外した。 光刺激前の30フレームで測定した平均ΔF/F値から5標準偏差離れたΔF/Fの増加を示す細胞を活性化細胞と定義した
光誘発運動量を解析するために、まず動物のセントロイドを認識するカスタムMATLABコードを使用して運動トレースを抽出した。 そして、移動距離を計測することで1秒ごとの移動速度を算出した。 光刺激中の15点の運動速度データを、それ以前の15点と比較し、光刺激によってその試行で速度が増加したかどうかを検証した。 動物レベルでは、光刺激中の運動速度の平均値を光刺激直前の運動速度の平均値と比較し、その動物で光刺激による運動量の増加が見られるかどうかを検討した。 光刺激によるマウンティングと子犬の回収については、まずビデオを盲検で採点した。 その後、ビデオログを光刺激ログと照合し、誘発行動の試行割合、開始潜時、全持続時間を抽出した。 光刺激中に発生した行動のみを光遺伝学的に誘導された行動としてカウントした。 光刺激前に発生し、光刺激中に発生した行動は光誘導行動としてカウントしない。 パラメータは、同一行動試行における光刺激期間、および複数試行がある場合は試行間で常に平均化された。 また、光刺激による行動の時間分布をプロットするために、行動が発生した光刺激期間のみを用いて平均化した。 また、オス、若ラット、偽仔ラットを刺激とした行動試行や、ChR2動物を去勢した場合は、光刺激期間直前の15秒間に発生した自発行動と光誘導行動を比較した。 次に、光刺激に遭遇した行動事象を抽出するために、ビデオログを光刺激ログに整合させた。 光刺激に遭遇した行動事象は、複数の試行が存在する場合は試行単位で平均化し、さらに動物単位で平均化することで、特定行動の各種パラメータをプロットした。
ChR2動物の活性化中心を模擬するため、各コロナ脳切片から一辺が正中線に近く、直角辺が脳底に近い1100×1500μmの領域を切り出し、1画素あたり1μmにリサイズした。 各100×100μmのc-FosシグナルをImageJとともにMATLABプログラムを用いて半自動的に抽出し、各セクション内の位置に応じて11×15マトリックスに合計した。 100μm2の正方形内のNeuN/HuCD+細胞の平均数は、〜25個と推定された。 横-内側および背-腹軸に沿った活性化中心の座標を計算するために、11×15マトリックス内の数値を、各動物について前後方向に広がる一連の脳切片で平均し、MATLABで2次元ガウス関数でフィッティングを行った。 活性化中心の前後座標を算出するために、各脳切片についてc-Fosの総数を合計し、単一のガウス関数でフィッティングした。
繊維光計測実験では、生の蛍光信号をさらに全体の傾向に従って調整し、光の白化を考慮した。 ジッター、信号の方形波、または極端に低い信号対雑音比を持つ試行は、さらなる分析から除外された。 初期反応については、蛍光変化量（ΔF/F）を（F-F0）/F0（F0はベースライン蛍光信号の中央値）の計算により導出した。 行動に合わせた蛍光シグナルについては、個々の試行内の行動イベントに基づいてデータを分割し、行動開始10-15秒前の平均シグナルをF0として使用した。 2 つの事象関連蛍光シグナルの統計的有意性を解析するために、偽発見率（FDR）0.05 の t 検定を用いた。 Ca2+過渡変化と行動を相関させるため、ΔF/F値がベースラインから3標準偏差を上回り、2秒以上継続した場合にramping Ca2+イベントをカウントした。最初と最後の行動の間でCa2+イベント数をカウントし、その期間の行動イベント数と相関させた。 2回以上のマウントと1回以上の回収があった行動トライアルのみを相関解析に用いた。
組織学的画像は、特に指定しない限り、共焦点顕微鏡の20倍の対物レンズで撮影した。 画像はカスタムメイドのMATLABコードを用いてImageJで処理され、カウントされた。 すべてのカウントは、動物の性別または試験条件について盲検化された実験者によって行われた。 ChR2のウイルス発現を解析するために、中央注入領域におけるChR2、c-FosおよびNisslの共標識は、手動でカウントされた。 Esr1とVglut2、Vgat、Galaninの共ラベルを解析するために、5つの脳切片の中から比較的固定された同様の位置の5箇所を選び、手作業でカウントした。 Esr1-cre動物におけるCre発現の特異性を調べるため、1匹の動物から得た複数のスライスの様々な領域において、Esr1とCreのco-labelingを手動でカウントした。 60倍の対物レンズで撮影したcatFISH実験の画像を定量するために、細胞質または核のc-FosおよびEsr1に対して陽性な細胞を、対染色としてDAPIを用いて認識し、手動で計数した。 Esr1+ニューロンのウイルス切除の効果を定量化するために、Allen Brain Atlasによって定義されるmPOAにおけるEsr1+シグナルを、Stereo Investigatorソフトウェア（MBF bBioscience）による不偏立体視を用いて両側について数えた。 具体的には、光分画プローブを用いて、100×100μmのサンプリンググリッド内の30×30μmのカウンティングボックスでEsr1+シグナルを列挙した。 Vgat+またはVglut2+ニューロンのウイルス切除の影響を定量化するために、脳切片をOlympus VS120を介して10倍の対物レンズで撮像した。 棒グラフでは、データは平均値±s.e.m.で示した。箱ひげ図では、データは最小から最大のひげで示し、平均値は「+」で示し、中央値は水平線で示すものとした。 特に指定がない限り、以下の統計的検定を行い、検定はすべて両側と指定した。 カテゴリーデータはフィッシャーの正確検定で分析した。 対のデータはpaired testで解析した。 累積分布の統計的差異を解析するために、2 標本 Kolmogorov-Smirnov 検定を用いた。 独立変数が1つのデータは、一元配置分散分析に続いて、ボンフェローニ補正によるポストホックテストで分析した。 独立変数が2つのデータは、二元配置分散分析に続いて、ボンフェローニ補正によるポストホックテストで分析した。 その他の比較では，Lillieforsの適合度正規性検定で分布の検定を行った． データが正規性検定に合格した場合、パラメトリック検定（Studentのt検定）が用いられた。 それ以外の場合は、ノンパラメトリックのWilcoxon順位和検定を用いた。 ピアソン相関のp値と相関係数は、相関の変換にスチューデントのt分布を使用して計算された。 *p < 0.05, **p ≤ 0.01, ***p < 0.001.
Data availability
All data in this study is available on request.
（参考文献）。