RNase A：よくある質問｜AGサイエンティフィックブログ

RNase入門

リボヌクレアーゼ（RNase）は、リボ核酸（RNA）分子を分解する大きな加水分解酵素のグループであり、RNaseは、RNAを分解する酵素です。 これらは、RNAをより小さな成分に分解する触媒作用のあるヌクレアーゼである。 4504>

3D conformation of ribonuclease A enzyme

これらの酵素は原核生物、真核生物などすべての生きた細胞や生物液に存在し、多くの重要な機能を果たしている。 RNase はどこにでも存在し、無防備な環境では非常に短い寿命である。 細胞毒性としては、RNAの切断によるタンパク質合成の阻害やアポトーシスの誘導がある。 これらの細胞毒性は、RNaseを細胞の外表面に作用させることで発現させることができるが、酵素を人為的に細胞質内に導入すると細胞毒性が1000倍になることが分かっており、細胞内への取り込みが毒性の律速段階であることが示されている。 エンドリボヌクレアーゼは、A、P、H、I、III、T1、T2、U2、V1、PhyM、およびV型である。

エキソリボヌクレアーゼには、PNPase、II、R、DおよびT型と同様にポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼIおよびエキソリボヌクレアーゼIIも含まれている。

最近、RNaseが癌の治療薬として注目されている。 周囲の正常な細胞に影響を与えずに、がん細胞を選択的に傷つける酵素を見つけることです。

RNase A products from AG Scientific, Inc.

よくある質問 RNase A

What is RNase A?

リボヌクレアーゼAは膵臓から分泌される消化酵素で、RNA（DNAは除く）ポリマーを特異的に「消化」または加水分解し、これらの分子中の隣接するリボヌクレオチド残基間の共有結合を形成するリン酸ジエステル結合をエンドヌクレアーゼで切断することにより加水分解します。

RNase Aの「A」とは何ですか？

名前の「A」は基質特異性ではなく、ウシの膵臓で作られる酵素の主な形態を表しています。

RNaseAは大量かつ高純度で入手できるため、タンパク質化学や酵素学の分野では画期的な研究対象であった。 また、この酵素の細胞毒性変異体や同族体は、化学療法薬として有用であることが証明されています。

リボヌクレアーゼAは、R. Bruce Merrifieldによって初めて合成された酵素でもあり、生体分子が単なる化学物質であり、人工的に構築することができることを示しました。 リボヌクレアーゼによって発見されたこれらの中心的な概念は、すべてノーベル賞を受賞しています。

RNase structure

分子量12600 Daの比較的小さな124アミノ酸配列のRNase Aは4つのHis残基を含み、そのうちHis12とHis119の2残基はこの酵素の触媒残基として直接関与しています。 His12のイミダゾール環はpK値が低く（pK < 6.0）、触媒作用のためには脱プロトン化されていなければならないことが示唆されている。

Ribonuclease Aはタンパク質ですか？

RNase Aは小さなタンパク質で、成熟した酵素は124アミノ酸残基しかなく、糖鎖は結合していません。 他の酵素と異なり、RNase Aは20種のアミノ酸のうち19種を含み、トリプトファンのみを欠いています。

作用機序は？

His12は一般塩基として働き、無柄リボ核糖リングの2′-OHプロトンを受容します。 これにより、より正電荷の高いリン（P）原子への2′-Oによる求核攻撃が促進され、2′-,3′-環状リボヌクレオチドリン酸中間体が生成されるのである。 この中間体の生成は、一般的な酸として働くHis119のイミダゾールによって促進され、そのプロトンは影響を受けやすいP-O-R’結合の酸素原子に供与される。

反応の第二段階では、これら二つのHis残基の側鎖の一般の酸および塩基活性は反転する。 His12は一般的な酸として働き，新たに獲得したプロトンを2′-，3′-環状リボヌクレオチドリン酸中間体に供与し，一方，一般的な塩基として働くHis119は水からプロトンを受け入れて同じ2′-，3′-環状中間体の水酸化物攻撃を促進する．

RNase Aの切断部位は？

RNaseAは、ピリミジンヌクレオチド（CおよびU）の3′-リン酸基とその隣接ヌクレオチド1、2、3の5′-リボース間のリン酸ジエステル結合を切断し、DNA標品中のRNA汚染物を効率的に加水分解します。 生成した中間体2′-,3′-環状ホスホジエステルは、さらに加水分解されて3′-一リン酸基となる。 ウシ膵臓RNase Aは、124アミノ酸からなる非常に安定なタンパク質で、一本鎖RNAに対する活性が最も高く、ウリジン残基に比べてシチジン残基では2倍速く切断されます。

RNaseAの酸/塩基触媒反応とは？

RNase Aも酸/塩基触媒反応で基質を化学変化させています。 酵素の酸性または塩基性残基は、遷移状態における発展電荷を安定化させるために、反応物との間でプロトンを移動させます。 プロトンの移動は通常、より良い脱離基を作り出し、反応をよりエネルギー的に有利にする。

ヒスチジンは、触媒作用に関与する非常に一般的なアミノ酸残基で、ヒスチジンのpKa値は中性に近く（pKa=6）、したがって、生理学的pHではプロトンを受け入れることも提供することも可能です。 たとえば、牛の膵臓からリボヌクレアーゼAを精製するある手順では、抽出物を硫酸で処理し、ほぼ沸騰するまで加熱しますが、生き残るのはリボヌクレアーゼAだけなのです。 膵臓から分泌され、消化管という人を寄せ付けない環境で仕事をする必要があるのだから、これは当然といえば当然だ。 リボヌクレアーゼAの安定性は、鎖の異なる部分を接着している4つのジスルフィド結合によるところが大きいです。

一般に、安定性を維持するために、製品の保管や取り扱いは業者の指示に従ってください。

RNase Aはどのようにして不活性化されますか？

RNase Aはかなり安定な酵素で、すべての哺乳類のすい臓リボヌクレアーゼに見られる、4つのジスルフィド橋があります。 橋が還元的に切断されると、タンパク質は変性し、不活性になる。 再酸化されるとタンパク質は再形成され、完全な活性が回復する。 しかし、橋を部分的に切断するだけで、酵素活性を維持することが可能である。 カルボキシル末端の4つのペプチドを取り除くと、酵素活性は失われます。

What inhibits RNase A?

RNase Aはどのようにストックから調製されますか。

RNase Aは通常、RNaseに影響を与えずに汚染されたDNase活性を除去するために、10分間煮沸することによって調製されます。 65℃に加熱してもRNaseに影響はありません。

RNase Aの調製済みストックの再構成方法

RNase Aは1～10 mg/mlの濃度で10 mM Tris-HCl, pH 7に溶解させることができます。5、15 mM NaClに溶解し、100℃で15分間加熱して、混入しているDNaseを不活性化した後、室温までゆっくり冷却し、分注します。

この酵素の作業濃度はどのくらいですか？

RNaseAの推奨作業濃度は用途に応じて1～100 μg/mLです。 本酵素は、幅広い反応条件下で活性を発揮します。 低塩濃度（0～100 mM NaCl）では、RNase Aは一本鎖および二本鎖RNA、さらにRNA-DNAハイブリッド中のRNA鎖を切断します。

この製品の保存温度と取り扱い方法について教えてください

密栓したバイアルに入れて-20℃で保存してください。 開封後はシリカゲル上で真空脱水を行い、-20℃に戻してください。 取り扱いにご注意ください。

RNaseAの用途は？

RNaseはすべての生物において、RNAの分解やターンオーバーに重要な役割を担っています。 リボヌクレアーゼ酵素は一本鎖RNAと複合体化することでRNAヘリックスをほどくことができます。

RNase AはRNA代謝や遺伝子発現の調節に機能するエンドリボヌクレアーゼで、自己免疫疾患、腎不全、すい臓疾患などの病気において重要な役割を果たすことが分かっています。 最近では、細胞毒性、細胞増殖抑制作用を持つRNase Aの抗腫瘍活性も報告されています。 RNase Aスーパーファミリーのメンバーは広く発現しており、哺乳類の血清や組織に存在しています。

この酵素は、タンパク質試料からRNAを加水分解するために使用することができます。 RNase保護アッセイ、非特異的に結合したRNAの除去、RNA配列の解析、タンパク質サンプルに含まれるRNAの加水分解、DNA精製に使用することができます。 なお、外観・形状はメーカーにより異なる場合があります。

Additional Reading

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