Isolation and Identification of Volatiles
De menselijke neus neemt veel VOC’s waar als geuren en deze geuren zijn vaak onze eerste aanwijzing dat er schimmels aanwezig zijn. Chemische karakterisering (isolatie, scheiding, identificatie en kwantificering) van VOC’s vereist echter gespecialiseerde analysemethoden, die niet lijken op de benaderingen die in de traditionele “natte” chemie worden gebruikt. Technologische vooruitgang aan het eind van de 20e en het begin van de 21e eeuw heeft ons vermogen om vluchtige stoffen precies, nauwkeurig en in lage concentraties te detecteren verbeterd (Zhang en Li, 2010; Hung et al., 2015). Kort samengevat omvatten de traditionele methoden stoomdestillatie en vloeistof-vloeistofextractie, gevolgd door concentratie en chemische verificatie van afzonderlijke verbindingen. Sommige van de vroegste studies naar de chemische aard van VOS werden uitgevoerd met methyleenchloride-extracten die werden geconcentreerd door stoomdestillatie en geanalyseerd met gas-vloeistofchromatografie en massaspectrometrie (MS). In een vroege studie waarbij deze aanpak werd gebruikt, werden de VOC’s van Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, en Aspergillus parasiticus geanalyseerd. Alle vier de soorten maakten 3-methylbutanol, 3-octanon, 3-octanol, 1-octen-3-ol, 1-octenol, en 2-octen-1-ol. Voor A. niger bestond meer dan 90% van het geïdentificeerde VOC-mengsel uit 1-octen-3-ol, de geurstof die paddestoelen hun karakteristieke geur geeft. Voor A. parasiticus maakte 1-octen-3-ol 35,6% uit van het totale vluchtige mengsel, terwijl de verwante acht-koolstofverbinding, 2-octen-1-ol, die een onaangename muffige-oliegeur heeft, 34,8% uitmaakte (Kamiński et al., 1974).
Methoden zijn sindsdien gebaseerd op gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), die chromatografische scheiding, identificatie door massaspectra en chromatografische retentie, en kwantificering van vluchtige monsters combineert. VOC’s in de headspace van schimmelculturen worden gewoonlijk opgevangen met behulp van vaste sorptieve materialen, zoals actieve kool of een vezel. Elke verzamelmethode heeft aangeboren biases en kan artefactvorming mogelijk maken; in het algemeen worden bij voorkeur apolaire verbindingen geoogst boven polaire. Gaschromatografie kan ook tot fouten leiden, omdat het soms moeilijk is twee verbindingen van elkaar te scheiden, waardoor ze door elkaar worden gehaald. Dit is geconstateerd in het geval van 2-methyl-1-butanol en 3-methyl-1-butanol, isomeren die alleen verschillen in de omzetting van één methylgroep (Börjesson et al., 1992). Andere nadelen van GC-MS-analyse zijn de noodzaak van geschoolde operatoren, de relatieve kostprijs en het feit dat het niet doeltreffend is bij meer reactieve VOS (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao en Martin, 2002; Rappert en Müller, 2005).
Solid-phase microextraction (SPME) is een populaire en draagbare methode. VOS worden eerst geabsorbeerd en geconcentreerd op een vezel, en vervolgens aan de detector afgegeven waar desorptie plaatsvindt in de GC-injector zelf. SPME is zeer geschikt voor het nemen van milieumonsters die dan terug naar het laboratorium worden vervoerd voor identificatie. Gekoppeld aan GC-MS is het een geschikt en veel gebruikt middel om VOS kwalitatief te identificeren uit microbiële culturen of uit verontreinigde gebouwen (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń en Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). SPME is vaak de beste aanpak voor het bepalen van de relatieve hoeveelheid van een vluchtige doelverbinding in een verkennende situatie, of voor herhaalde bemonsteringsprocessen. Het is echter niet nuttig voor de identificatie van nieuwe verbindingen.
Er zijn vele gespecialiseerde analysemethoden ontwikkeld die de klassieke GC-MS-benaderingen aanvullen en nuttig kunnen zijn voor gerichte analyses. Zo is proton transfer reaction-massaspectrometrie (PTR-MS) nuttig voor het nemen van snelle monsters en voor het detecteren van lage concentraties (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Deze methode wordt gebruikt in de milieuwetenschap, de levensmiddelentechnologie en de medische diagnose (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al, 2013).
Met behulp van thermische desorptie (TD)-gaschromatografie/massaspectroscopie is het in vitro vluchtige metabolietenprofiel van Aspergillus fumigatus gekarakteriseerd, waarbij een onderscheidende signatuur is vastgesteld die de monoterpenen camfeen, α- en β-pineen, en limoneen bevat; en de sesquiterpeenverbindingen α- en β-trans-bergamoteen (Koo et al., 2014).
Selected ion flow tube-massaspectrometrie (SIFT-MS) heeft het vermogen om microbiële VOC’s te detecteren met snelheid en gevoeligheid in een matig complex gasmengsel. Het is in staat om VOC’s in lage deel per miljard concentraties aan te pakken en kan bepaalde verbindingen meten in het deel per triljoen bereik. Bij deze techniek worden de totale VOS geïoniseerd in een stromingsbuis, zonder dat chromatografische scheiding nodig is (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). De methode is gebruikt om VOC’s te kwantificeren die worden uitgestoten door A. fumigatus in cocultuur met bacteriën die vaak worden aangetroffen in zieke menselijke longen. Culturen met A. fumigatus produceerden “overvloedige” hoeveelheden ammoniak en de organische zwavelverbindingen methanethiol (ook bekend als methylmercaptaan), dimethylsulfide en dimethyldisulfide (Chippendale et al., 2014).
Simultane destillatie-extractie (SDE) omvat een korte silicavezel bedekt met organisch materiaal als stationaire fase om VOS te concentreren die vervolgens worden gedesorbeerd in een hete injector. SDE is gebruikt voor het bepalen van vluchtige componenten in milieu-, voedsel-, forensische, olie-, farmaceutische en polymeeranalyses om meer geconcentreerde monsters te verkrijgen (Orav et al., 1996). Zo zijn bijvoorbeeld bepaalde smaakstoffen bestudeerd met een combinatie van SDE en SPME. Smaakstoffen kunnen kwantitatief worden geanalyseerd met SDE, terwijl SPME wordt gebruikt voor eenvoudige, snelle, routinematige screening (Cai et al., 2001).
Multicapillaire kolom-ionmobiliteitsspectrometer (MCC-IMS) heeft een gevoeligheid tot het deel per triljoen bereik, hoge snelheid, en vereist weinig technische kennis. Karakteristieke metabolieten van A. fumigatus en Candida-soorten zijn met deze aanpak onderscheiden in hoofdruimte-analyse (Perl et al., 2011).
Elektronische neuzen (e-noses) vertalen vluchtige stoffen in elektrische signalen op basis van interactie met elektronische oppervlakken en kunnen worden gebruikt voor het detecteren van bekende verbindingen. E-noses bestaan uit een groep chemische sensoren met verschillende selectiviteiten, een signaalvoorverwerkingseenheid en een patroononderscheidend systeem (Gardner en Bartlett, 1994). Verschillende VOC’s vormen een karakteristieke vingerafdruk die kan worden onderscheiden door vergelijkingen met eerder in het herkenningssysteem geregistreerde patronen. De medische toepassing van e-noses was oorspronkelijk gericht op bacteriële pathogenen of niet-infectieuze ziekten zoals longkanker, chronische obstructieve longziekte en astma (Valera et al., 2012). Afhankelijk van de toepassing worden VOC-monsters uit swabs, sputum, serum, feces, adem of urine gebruikt voor diagnostische doeleinden. Ademmonsters zijn gebruikt voor de vroege detectie van aspergillose (de Heer et al., 2013).
Er blijven veel technische uitdagingen bij het werken met schimmel VOC’s, en het is vaak moeilijk om de verkregen resultaten tussen verschillende laboratoria te vergelijken. Dezelfde schimmelsoort kan verschillende VOC-profielen hebben op basis van onbekende of ongecontroleerde omgevings- en genetische factoren. Bovendien kan het gebruikte experimentele protocol het VOC-profiel drastisch beïnvloeden. Zo detecteerden de Lucca et al. (2010) in hun werk met Aspergillus flavus slechts één terpeen door SPME te gebruiken om vluchtige stoffen te verzamelen alvorens ze aan GC-MS te onderwerpen. Later konden de Lucca et al. (2012) met behulp van een monsterconcentrator en een ander model GC-MS-instrument verschillende terpenen onderscheiden. De manier waarop de materialen worden behandeld vóór het experiment kan leiden tot artefacten en autoclaveren kan de vorming van niet-biogene vluchtige stoffen veroorzaken (Börjesson et al., 1992). Aangezien de gegevens vaak niet consistent zijn doorheen de proeven, hebben sommige auteurs de reproduceerbaarheid van microbiële VOC-emissies in vraag gesteld (Schleibinger et al., 2002). Toekomstig werk met fungale VOC’s moet rekening houden met de vele factoren die de resultaten kunnen beïnvloeden. Het zou nuttig zijn als er richtlijnen voor beste praktijken werden ontwikkeld door de gemeenschap van wetenschappers die schimmel VOC’s bestuderen.