18O labeling: een hulpmiddel voor proteomics

Een evaluatie van de proteolytische labeling en kwantificering van eiwitten voor diagnostische doeleinden met behulp van trypsine en 18O-verrijkt H2O wordt gepresenteerd. Wij tonen aan dat vergelijkende of relatieve kwantificering effectief kan worden uitgevoerd met deze aanpak. We hebben een protocol dat het behoud van de gelabelde peptiden in natuurlijke overvloed water mogelijk maakt zonder angst voor back-exchange op voorwaarde dat de pH voldoende laag is om de katalytische activiteit van trypsine doven, maar niet zo laag dat de chemische back-exchange te bevorderen. Omdat de etiketteringsefficiëntie afhangt van de aard van de peptide, bestaat er geen eenvoudig lineair verband tussen de relatieve 16O/18O-destructiebuffermengselinhoud (x) en de etiketteringsefficiëntie (y); in plaats daarvan volgt het een op waarschijnlijkheid gebaseerde y = x(2) relatie. Als zodanig kan de mate van peptide-etikettering bij gebruik van 16O/18O-destructie-buffermengselverhoudingen aanzienlijk afwijken van hetgeen op basis van een lineair verband wordt verwacht. De evaluatie van de relatieve Ziptip-efficiëntie gaf een verlies in monsterextractie aan naarmate de peptideconcentratie onder normale omstandigheden werd verlaagd, hetgeen suggereert dat er een grens is waarbeneden er een afnemende opbrengst is. Bovendien gaven de adsorptieverliezen door Speedvac-droging en -terugwinning een bescheiden verlies (20%) te zien, dat van peptide tot peptide sterk kan variëren (0-50%). De in-solutie-ontsluitingsefficiëntie van standaardeiwitmengsels als functie van de concentratie vertoonde een lineaire afname met afnemende concentratie. Dit is consistent met enzym kinetische effecten en benadrukt een mogelijke kwantificatiefout die kan optreden bij het evalueren van differentiële expressie op basis van peptide detectie. De resultaten van onze studies tonen de kracht van 18 O-labeling als een optimalisatie-instrument voor proteomics procesontwikkeling.