Het algemene doel van deze hemagglutinatieremmingstest is het meten van de antilichaamtiters tegen specifieke virussen van belang. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vaccinologie over de vaccinatie-gemedieerde immuniteit en bescherming binnen verschillende populaties en over verschillende leeftijds- en patiëntengroepen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat zij accuraat is en dat zij een snelle bepaling van de titer van de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen mogelijk maakt.
Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in menselijke antilichaamtiters, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, zoals antilichaamtiters voor muizenserum, ook kweeksupernatanten. Begin met het etiketteren van 96 wells microtiterplaten met de juiste experimentele informatie. Draai vervolgens de plaat in verticale stand en gebruik een meerkanaalspipet om 25 microliter PBS toe te voegen aan elk putje, behalve aan het eerste putje van de onderste rij voor terugtitrering.
Voeg 50 microliter van de vers bereide antigeenoplossing van belang toe aan het eerste putje van de rij voor terugtitrering, gevolgd door de toevoeging van 25 microliter met RDE behandelde serummonsters aan de eerste putjes van de bovenste tien rijen. Voeg 25 microliter van het juiste antiserum toe aan het eerste putje van de elfde rij als positieve controle. Breng 25 microliter van het eerste putje van elke rij over naar de daaropvolgende putjes om seriële, tweevoudige verdunningen uit te voeren.
Pipetteer 10 tot 15 keer op en neer voor elke verdunningsstap en gooi de laatste 25 microliter uit de laatste putjes weg. Vervolgens 25 microliter van de antigeenoplossing toevoegen aan elk putje van de rijen 1 t/m 11 en 25 microliter PBS alleen aan elk putje van de achterste titreringsrij. Tik de plaat voorzichtig 10 keer aan alle vier de zijden om te mengen.
Dek de plaat vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur af. Voeg aan het einde van de incubatie 50 microliter rode bloedceloplossing toe aan elk putje en meng de plaat door nogmaals te tikken. Dek vervolgens de plaat weer af en incubeer de rode bloedcellen volgens de gebruikte soort zoals aangegeven in de tabel.
Nadat de rode bloedcellen aan de plaat zijn toegevoegd, moet de juiste incubatietijd worden aangehouden voor de soort bloed die in de assay wordt gebruikt. Een te korte of te lange incubatie zal leiden tot een onjuiste interpretatie van de resultaten. Beoordeel aan het eind van de incubatie de hemagglutinatie door de plaat gedurende 25 seconden 90 graden te kantelen en markeer de resultaten voor elk putje, terwijl de plaat nog gekanteld is, op een afgedrukt schema van de 96 wells-plaat.
In dit experiment werd de vaccin-geïnduceerde antilichaamrespons beoordeeld bij 26 gezonde vrijwilligers die voorafgaand aan het 24 2015-griepseizoen een geïnactiveerd, trivalent influenzavaccin met influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 en B/Massachusetts/O2/2012 hadden gekregen. Er werd een kruisreactieve immuunrespons voor A/H3N2/Zwitserland/2013 en A/H3N2/Texas/2012 virusstammen waargenomen, met significant lagere geometrisch gemiddelde hemagglutinatieremmingstiters en geïnduceerde seroprotectie tegen influenza A/H3N2/Zwitserland/2013 in vergelijking met influenza A/H3N2/Texas/2012. Na vaccinatie stegen de antilichaamtiters tegen beide stammen, ook al was de A/H3N2/Zwitserland/2013 stam niet aanwezig in het vaccin.
Viraal hemagglutinine vertoont een soortafhankelijk potentieel voor erytrocyten hemagglutinatie. Interessant is dat bloed van cavia’s niet goed hemagglutineert met influenza B en dat bloed van kalkoenen wel hemagglutinatie kan veroorzaken met hoge titers en een lage kruisreactiviteit. Wanneer deze techniek eenmaal onder de knie is, kan zij binnen drie uur worden voltooid, mits zij op de juiste wijze wordt uitgevoerd.
Bij deze procedure is het belangrijk te onthouden dat een serum met RDE wordt gebruikt om eventuele niet-specifieke remmers en niet-specifieke binding tijdens de hemagglutinatie van het virus te inactiveren. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals ELISA worden uitgevoerd om bijkomende vragen te beantwoorden over de rol van individuele pathogeenspecifieke immunoglobulinen. Na zijn ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van virale immunologie om ons begrip van vaccin-gerelateerde immuniteit bij gezonde en immuno-onderdrukte patiënten binnen verschillende leeftijdsgroepen te vergroten.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een hemagglutinatieremmingstest moet worden uitgevoerd om influenzastam-specifieke antilichaamtiters op grote schaal te kwantificeren. Vergeet niet dat het werken met virale antigenen, dierlijk bloed en humane serummonsters uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het werken in een BSL2 laboratorium altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.