Analyse en kwantificering van in vitro myoblast fusie met behulp van de LADD Multiple Stain

Volwassen skeletspierweefsel bevat een populatie van voorlopercellen, bekend als satellietcellen, die verantwoordelijk zijn voor het herstel van de skeletspier (1-3). Geactiveerde satellietcellen (myoblasten) migreren naar de plaats van het spiertrauma, waar zij prolifereren, differentiëren en samensmelten tot multinucleaire myotubes (3-5). Het uiteindelijke succes van dit proces wordt gemeten aan de hand van de mate waarin residente myoblasten tijdens de terminale differentiatie zijn gefuseerd.

Om myoblastfusie in vitro experimenteel te evalueren, wordt een fusie-index berekend op basis van detectie van immunofluorescentie door microscopie. Fluorescent gelabelde antilichamen worden gebruikt om spiervezel structurele eiwitten zoals myosine zware keten (MyHC) en desmin detecteren, of als alternatief kan fluorescent gelabelde phalloidin worden gebruikt om F-actine (6-9) visualiseren. Nuclei worden fluorescent gelabeld met een DNA-bindende verbinding zoals Hoechst 33258. Vervolgens wordt het percentage kernen in myocyten met ≤ 3 kernen (9) of het percentage kernen in MyHC-positieve myotubes (10) berekend. Deze benaderingen zijn goed ingeburgerd; zij vereisen echter uitgebreide, tijdrovende optimalisatie voor het genereren van een sterk en specifiek signaal voor het antigeen van belang en de daaropvolgende fusie-analyse. Indien gebruik wordt gemaakt van fluorescent gelabelde antilichamen, is de toegang tot een fluorescentiemicroscoop een bijkomende vereiste die niet in alle instellingen beschikbaar is. De daaropvolgende kwantificering vereist een bewerkelijke en tijdrovende analyse van talrijke beeldvelden om een fusie-index te verkrijgen die representatief is voor de populatie. Deze beperkingen, samen met de relatieve kosten van antilichaam-gebaseerde assays, zette ons aan tot het ontwikkelen van een snelle, kosteneffectieve in vitro assay voor kwantificering van myoblast fusie met behulp van de alom verkrijgbare LADD Multiple Stain.

De LADD Multiple Stain (11) is een gecombineerde nucleaire en cytoplasmatische vlek die fuchsine en toluidine blauw bevat (Cat. # 70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Voor onze studies wordt verse LADD bereid met 0,365 g toluïdineblauw (cat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en 0,135 g fuchsine (cat. #47860-25G; Sigma-Aldrich) in een eindvolume van 50 ml 30% ethanol. De oplossing wordt gemengd tot ze is opgelost en vervolgens gefiltreerd door Whatman (nummer 4) filtreerpapier (cat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). De LADD-kleuring kan in een plastic of glazen houder bij kamertemperatuur worden bewaard en kan opnieuw worden gebruikt. De te kleuren cellen worden gewassen met PBS (phosphate-buffered saline) en gedurende 10 minuten gefixeerd in 70% ethanol. De ethanol wordt verwijderd en 500 µL LADD-kleuring wordt toegevoegd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de cellen volledig worden bedekt. De cellen worden gedurende 1 min geïncubeerd, waarna de kleuring wordt verwijderd en de cellen herhaaldelijk met gedestilleerd water worden gewassen totdat de LADD niet meer in het water loogt. De cellen worden vervolgens te drogen gelegd en bij kamertemperatuur bewaard totdat ze met fasecontrastlichtmicroscopie worden bekeken. Om de verlichting te verbeteren tijdens het bekijken, kunnen de gekleurde cellen worden ondergedompeld in PBS.

Om te bepalen of deze vlek met succes kan worden gebruikt om myoblast fusie visualiseren, werden C2C12 cellen gekweekt tot 80% confluentie (Figuur 1A) onder standaard kweekomstandigheden (12). De media werd vervolgens veranderd in differentiatie media met 2% paardenserum, wat resulteert in fusie in myoblasten (figuur 1B). Succesvolle differentiatie werd bevestigd door verhoogde expressie van MyHC (figuur 1D) in vergelijking met ongedifferentieerde cellen (figuur 1C). Na LADD kleuring, de ongedifferentieerde C2C12 myoblasten vertonen een licht paars cytoplasma en een donkerder kern (figuur 1E; pijl). Echter, na differentiatie, myotube cytoplasma verschijnt donker paars (Figuur 1F; pijlpunten), terwijl lichtere kernen zijn duidelijk zichtbaar binnen de multinucleated cel (Figuur 1F; pijl). Daarom, na LADD Multiple Stain, duidelijk gedefinieerde kernen worden waargenomen en zijn zo gemakkelijk te onderscheiden van het cytoplasma van de multinucleated myotube (figuur 1F) zoals bekeken met behulp van fluorescentiemicroscopie na immunocytochemie (figuur 1D).

Om te bepalen of beeldanalyse kan worden gebruikt om de voortgang van myoblast fusie te meten, werden C2C12 cellen gedifferentieerd gedurende 6 dagen, en beelden van LADD-gekleurde cellen genomen bij 200 × vergroting met behulp van een Olympus CKX41 omgekeerde lichtmicroscoop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan). Zoals verwacht, het aantal fuserende myocyten en myotubes duidelijk toegenomen bij elke volgende differentiatie dag (Figuur 2A). Een fusie-index werd vervolgens berekend, en differentiërende myoblasten werden gezien om stapsgewijs verhogen hun fusie-index van 0,45% (dag 1) tot 31,4% (dag 6) (figuur 2B). De fusie-index afgeleid op deze manier gunstig afsteekt bij de index berekend met behulp van standaard immunocytochemie (om MyHC detecteren) en nucleaire kleuring (13). Om te bepalen of ImageJ analyse software (https://imagej.nih.gov/ij/) kan worden aangepast aan myofiber gebied (als een maatregel van fusie) te kwantificeren, werd een macro ontwikkeld en getest op de beelden die door Figuur 2A. De macro is ingesteld als volgt en vervolgens opgeslagen:

• Open ImageJ en klik op “Plugins = > Macros = > Opstart Macros”

• Vervang de bestaande tekst met de codering in de aanvullende tabel S1.

De afbeeldingen worden geopend in ImageJ, en de macro wordt uitgevoerd door te klikken op “Macros = > Macro uitvoeren”. Hierdoor worden de afbeeldingen één voor één geanalyseerd. De gebruiker moet bevestigen dat de drempel correct is ingesteld; alleen het myofibergebied moet worden geanalyseerd. De kleurdrempel kan worden gewijzigd door de macro-regel “setThreshold(0,130)” te bewerken; door het tweede getal te verhogen worden meer licht gekleurde gebieden opgenomen, terwijl meer gebieden worden uitgesloten wanneer dit getal wordt verlaagd. Met behulp van deze methode, myofiber gebied bereikt 29,6% op dag 6 (figuur 2C), goed te vergelijken met de fusie-index berekend voor hetzelfde tijdstip (figuur 2B). Jenner en Giemsa kleurstoffen kunnen ook worden gebruikt om myotubes vlekken voor lichtmicroscopie in vrijwel dezelfde manier als LADD, maar kleuring met LADD is vele malen sneller, en de ImageJ macro die we hebben ontwikkeld zorgt voor een grotere controle over welke gebieden worden gemeten (14).

Om verder te valideren het gebruik van de LADD Multiple Stain voor fusie-analyse, werden C2C12 cellen gedifferentieerd gedurende 5 dagen in de aanwezigheid of afwezigheid van 10 µM BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) en vervolgens gefixeerd en gekleurd met LADD zoals eerder beschreven. BB94 is een in de handel verkrijgbare synthetische matrix metalloprotease remmer waarvan eerder is aangetoond dat hij de fusie van myoblasten vermindert (15,16). In aanwezigheid van BB94, de fusie-index daalde significant van 50% (DMSO controle) tot 22% (P < 0,05) (Figuur 2D); analyse van de myofiber gebied bleek dezelfde trend, met fusie verminderd van 46% (DMSO controle) tot 21% (P < 0.05) in aanwezigheid van BB94 (Figuur 2E).

Hier presenteren we een snelle, nieuwe methode voor het kleuren van zowel myofiber structuur en bijbehorende myonuclei met behulp van de LADD Multiple Stain. ImageJ wordt vervolgens gebruikt om nauwkeurig te evalueren spiervezel gebied als een maat voor fusie. De relatief lage kostprijs van LADD en de sterk verminderde tijd nodig voor verwerking en analyse betekent dat fusie nu snel kan worden geanalyseerd in een standaard laboratorium zonder de noodzaak van immunocytochemie en fluorescentiemicroscopie.