Axiale resolutie

1.43.2 Het pleidooi voor superresolutiemicroscopietechnieken

Laterale en axiale resoluties in de lichtmicroscoop zijn fundamenteel diffractiebegrensd in de relatie tussen de golflengte van het licht en de opening, of acceptatiehoek, van de objectieflens die wordt gebruikt voor de beeldvorming, zoals beschreven door Ernst Abbe in 1873. In de laterale dimensie is deze resolutielimiet ongeveer 200 nm, en in de axiale dimensie is de limiet ongeveer 500 nm. De diffractielimiet van de optische microscopie is het gevolg van de fundamentele beperkingen van de optiek die bij de beeldvorming wordt gebruikt. Als we het beeld beschouwen dat wordt gevormd door een subresolutie sferische lichtbron, dan zien we dat het beeld dat resulteert uit zelfs perfect gecorrigeerde, aberratievrije microscoopoptiek niet wordt beschreven door een eenvoudige bol. In feite wordt een complexe 3D-intensiteitsverdeling in het brandpunt waargenomen, en deze 3D-intensiteitsverdeling kan mathematisch worden beschreven door de point spread function (PSF) (figuur 1). Het centrale maximum van de PSF bevat 86,5% van de totale beschikbare energie-intensiteit. In zowel de laterale als de axiale dimensie wordt de resterende energie-intensiteit op rotatiesymmetrische wijze in kaart gebracht in een reeks maxima en minima. Het is de interactie van PSF’s van aangrenzende beeldkenmerken die uiteindelijk de diffractieresolutielimiet van de lichtmicroscoop bepaalt.

Figuur 1. XY (a) en XZ (b) intensiteitskaarten van een ideale point spread function.

Wanneer twee objecten elkaar in de ruimte naderen, overlappen hun PSF’s elkaar en kunnen de twee objecten weldra niet meer van elkaar worden onderscheiden. De minimale overlapping van twee PSF’s die kan worden getolereerd voordat het vermogen om de twee van elkaar te onderscheiden verloren gaat, is beschreven als het punt waarop de intensiteit tussen de twee PSF’s met ongeveer 25% afneemt. Het punt waarop deze intensiteitsdaling wordt bereikt, komt overeen met de afstand tussen het centrale maximum en het eerste minimum van de PSF. Het is zeer moeilijk deze afstand nauwkeurig te bepalen omdat het moeilijk is het minimum nauwkeurig te positioneren, en in plaats daarvan wordt gebruik gemaakt van de halve maximale breedte (FWHM) van het centrale maximum van de PSF.

Uit beide vergelijkingen blijkt dat de laterale en axiale resoluties afhankelijk zijn van de numerieke apertuur van het optische systeem dat het licht opvangt en van de golflengte van het licht zelf. Een beter oplossend vermogen wordt verkregen door gebruik te maken van objectieven met een grote numerieke apertuur en van licht met een kortere golflengte. Andere factoren, zoals de relatieve helderheid van de twee objecten (contrast), beïnvloeden deze minimale afwikkelbare afstand. In praktische termen, in microscoop beeldvorming, zowel voldoende optische numerieke apertuur en voldoende contrast nodig zijn om nauwkeurig subcellulaire detail.

Lager de verlichting golflengte in het ultraviolette bereik om de resolutie te verbeteren beperkt men de keuzes van fluorescerende probes, en duwt de grenzen van optische correcties en de transmissie-eigenschappen van het optische pad van de microscoop. Verdere complicaties komen voort uit het gebruik van ultraviolette verlichting in studies met levende cellen, waar veel onderzoekers de schadelijke effecten van deze golflengten op de levensvatbaarheid van de cellen op lange termijn hebben opgemerkt. Moderne optische ontwerpen hebben de numerieke aperturen van lenzen verbeterd, hoewel echte verbetering in dit opzicht alleen is gekomen door het gebruik van exotische bevestigingsmedia en dekglasmaterialen. Beide strategieën niet meer dan een bescheiden verbetering van de resolutie te maken en komen ten koste van het zijn onpraktisch voor levende cel studies.

Biologische confocale microscopie, die een pinhole diafragma gebruikt om in-focus contrast te verbeteren door de effectieve verwijdering van strooilicht van out-of-focus object vlakken, is uitgegroeid tot een standaard beeldvormingsinstrument in de studie van cellulaire structuur-functie relaties. De verbetering van de visualisatie van het in-focus beeldvlak maakt het mogelijk gemakkelijker de praktische diffractielimieten van de resolutie te bereiken wanneer het instrument kritisch is afgesteld. Theoretisch, met pinhole aperturen van minder dan 1 Airy eenheid, laterale en axiale resoluties daadwerkelijk verbeteren tot een limiet van 1,4 maal die van het brede-veld microscoop geval. In de praktijk leveren pinhole-diameters van minder dan 1 Airy-eenheid echter te weinig licht op voor biologische beeldvorming, aangezien een groot deel van de onscherpe straling samen met het ongewenste onscherpe licht door het pinhole wordt afgestoten. Voor biologische beeldvorming, waarbij men gewoonlijk worstelt om het emissiesignaal te verkrijgen, is het verwerpen van een deel van dit beperkte signaal voor een kleine winst aan resolutie onpraktisch. Wanneer het emissiesignaal van het monster beperkt is, kiest men er gewoonlijk voor het pinhole te openen tot diameters groter dan 1 Airy-eenheid om meer signaal te verzamelen ten koste van een grotere optische dikte van het slice. Bij deze pinhole diameters is de resolutie van de confocale microscoop in wezen gelijk aan die van een conventionele breedveld fluorescentiemicroscoop.

Dit wil niet zeggen dat men geen objecten kan detecteren die kleiner zijn dan de resolutielimiet – detectie zelfs op het niveau van enkele moleculen is mogelijk, en nu relatief eenvoudig met behulp van moderne detector technologieën. De volledige verwijdering van de directe verlichting die het objectief binnenkomt bij donkerveldmicroscopie zorgt voor een uitstekend contrast, zodat zelfs de kleine hoeveelheid licht die wordt verstrooid door diffractiebeperkte objecten zoals microtubuli (25 nm diameter) gemakkelijk kan worden waargenomen. Fluorescentiemicroscopie biedt ook uitstekende contrastomstandigheden die de observatie en registratie mogelijk maken van objecten die afmetingen hebben die ver onder de diffractiegrens van de resolutie liggen. Met totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie, wordt het contrast verbeterd van standaard breedveld fluorescentie microscopie door het beperken van de axiale excitatie tot een paar honderd nanometer van de vloeistof-coverglass interface door gebruik te maken van de evanescente, near-field licht energie voor fluorofoor excitatie. Onder deze omstandigheden kan zelfs de mobiliteit van een enkele molecule in de tijd worden gevolgd binnen een zeer dunne optische doorsnede. Echter, noch dark-field noch TIRF microscopie verbetert de resolutie van het optische systeem – beide technieken vertrouwen op grote contrastverschillen tussen het object van belang en de achtergrond om subresolutie detectie mogelijk te maken.

Het overschrijden van de klassieke diffractie resolutielimieten is een grote uitdaging geweest in de moderne lichtmicroscopie. De voordelen van het verbeteren van ons vermogen om fijnere details op te lossen van de optische microscoop zijn duidelijk. Een hogere resolutie zou een meer accurate structurele beschrijving mogelijk maken van moleculaire organisaties die fundamenteel zijn voor normale en abnormale cellulaire fysiologie en gedrag. Moleculaire en biochemische dissecties gaan slechts zo ver in het onthullen van de complexiteit in functionele organisaties zoals die gevonden worden bij adhesie focale contacten. In staat zijn om direct te visualiseren, met resoluties benaderen van de moleculaire dimensie, deze functionele organisaties zou aanzienlijk toenemen ons begrip van moleculaire onderlinge relaties en veranderingen in de organisatie in verband met functionele of fysiologische toestanden. Recentelijk hebben een aantal onderzoekers verschillende strategieën uitgebuit om substantiële (2- tot 10-voudige of beter) verbeteringen aan te brengen in de klassieke laterale en axiale resolutielimieten. Deze technieken vallen uiteen in twee algemene categorieën: die welke berusten op veranderingen in de belichting van het specimen, en die welke gebruik maken van single-molecule detectie strategieën samen met de tijdsdimensie om een superresolved beeld op te bouwen.

Voor de doeleinden van dit artikel zijn de technieken gekozen die hebben geleid tot de ontwikkeling en introductie van commerciële instrumenten door verschillende fabrikanten. Het gebruik van dit specifieke criterium bij de selectie van de hieronder besproken methoden mag geenszins worden geïnterpreteerd als een bekrachtiging van deze technieken boven andere die in de literatuur zijn geïntroduceerd. Naarmate de werkzaamheden op dit snel veranderende gebied zich verder ontwikkelen, kan het zijn dat nieuwe methoden en benaderingen die welke hieronder worden beschreven, inhalen. De introductie van deze commerciële instrumenten op de markt stelt echter een breed scala van biologen uit verschillende disciplines in staat superresolutiemethoden toe te passen op hun eigen specifieke biologische vragen, waardoor deze methoden niet langer worden gebruikt in gespecialiseerde ontwikkelingslaboratoria. Lezers worden aangemoedigd om zelf de beelden van hoge kwaliteit te onderzoeken die zijn opgenomen in het online aanvullend materiaal bij veel van de artikelen waarnaar wordt verwezen.