Inleiding
Er zijn ongeveer 10.000 met name genoemde soorten microben. Geschat wordt dat er tussen de 10.000 en 100.000 meer niet-geïdentificeerde soorten zijn voor elke geïdentificeerde soort. Er zijn niet alleen veel soorten bacteriën, er zijn ook veel individuele bacteriën. Een enkele lepel aarde kan 100 miljoen individuele bacteriën bevatten. Een schraapsel van je tandvlees kan 1 miljoen bacteriën per cm2 opleveren (een cm2 is ongeveer de grootte van je kleine vingernagel). De bacteriën in en op ons lichaam maken ongeveer 10% uit van ons droog lichaamsgewicht.
De meeste bacteriesoorten die momenteel bekend zijn, zijn geïdentificeerd met behulp van traditionele microbiologische technieken, zoals de gramkleuringreactie, morfologie en metabolische reacties. Bacteriën leven zelden alleen, maar in gemeenschappen met andere bacteriën. Dit geldt zowel in het milieu als in en op ons lichaam. Deze les richt zich op de rol van bacteriën bij ziekte. Het isoleren van een enkele bacteriesoort is de eerste stap in het identificeren van de bacteriën die mogelijk verantwoordelijk zijn voor een ziekteproces.
De eerste vereiste voor het fysiek isoleren van een bacterie is dat deze in het laboratorium gekweekt kan worden. Dit vereist kennis van de optimale temperatuur voor groei, de optimale zuurstofbehoefte en de optimale voedingsbehoefte. In deze cursus werken we met een zeer beperkt aantal bacteriën. De bacteriën waarmee we werken zijn ook zeer gemakkelijk in het laboratorium te kweken. De meeste bacteriën zijn niet zo aangenaam!
Er zijn twee hoofdmanieren om organismen te isoleren.
- Het isoleren op een agarplaat
- De gietplaatmethode
Het isoleren op een agarplaat houdt de opeenvolgende verdunning van organismen in totdat je de cellen op een dusdanig lage dichtheid hebt dat afzonderlijke cellen fysiek ruimtelijk geïsoleerd zijn om herkenbare individuele kolonies te doen ontstaan. Bij de gietplaatmethode wordt het monster voldoende verdund voordat het aan afgekoelde gesmolten agar wordt toegevoegd en vervolgens wordt dit mengsel in een schaal gegoten. De geïsoleerde cellen vormen individuele kolonies die in de agar zelf groeien. Deze techniek kan een beetje lastig zijn. Als de gesmolten agar te heet is, dood je alle bacteriën. Als de gesmolten agar te koel is, eindig je met een grote klomp in je petrischaal. De streaking-methode levert individuele kolonies op het oppervlak van de agar op. Deze techniek is veel sneller en gemakkelijker onder de knie te krijgen.
Overzicht
Je krijgt een bouillonmonster met drie organismen, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens, en Escherichia. coli.
Alledrie de organismen groeien gemakkelijk aëroob op tryptische soja-agar (TSA). S. marsescens vormt echter alleen een rood pigment bij 35°C of minder en optimaal bij kamertemperatuur (25°C). Het groeit bij alle temperaturen zeer snel tot middelgrote kolonies.
E. coli ziet er bij alle temperaturen bruin uit en is ook een snelle groeier die grote kolonies vormt.
S. xylosus ziet er bij alle temperaturen geeloranje uit, groeit snel en vormt middelgrote tot grote kolonies.
U kunt de drie organismen op uw plaat isoleren en waarnemen als de juiste incubatieomstandigheden aanwezig zijn. Uw platen worden gedurende 48 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. U moet in staat zijn om de drie organismen te identificeren op basis van koloniegrootte en pigment.
Materialen
- 1 gemengde cultuur in tryptische sojabouillon (TSB) buis met Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens, en Escherichia. Coli (alle BSL2)
- 3 TSA-platen
Strepen voor isolatieprocedure
Er zijn verschillende methoden van strepen voor isolatie. De overgrote meerderheid van onze studenten zijn het meest succesvol met de kwadrant methode van strepen die hieronder wordt beschreven.
- Label uw plaat met uw naam, datum, sectie, en organisme.
- Gebruik BSL2 procedures om een lus-vol van organismen uit uw tryptische soja bouillon (TSB) buis te verkrijgen. Raadpleeg het protocol voor aseptische technieken.
- Zorg ervoor dat u uw bouillonbuisje goed hebt gemengd, zodat de organismen gelijkmatig in de bouillon zijn gesuspendeerd.
- Herschenk uw TSB-buisje.
- Het volgende gedeelte kunt u doen met uw bord op de laboratoriumtafel of met het bord in uw hand. U beslist wat het beste werkt. Sleep uw lus lichtjes heen en weer over het oppervlak van de agar. (Zie figuur 1.)
- Hoe meer je sleept, hoe meer bacteriën je deponeert.
- Het algemene idee is om de bacterieconcentratie met elke veeg te verlagen.
- Vier tot vijf zigzaggen lijkt goed te werken.
- Experimenteer met je verschillende platen. Houd bij wat je op elke plaat hebt gedaan.
- Als je een verbrandingsoven gebruikt, steriliseer dan je lus. Als u plastic lussen gebruikt, gooit u uw gebruikte lus in de cavicide-container en haalt u een nieuwe steriele plastic lus.
- Ga niet terug in de oorspronkelijke bouillonbuis.
- Tik met uw lus op het agar-oppervlak tegen het uiterste uiteinde van uw eerste streepje. Herhaal dit door heen en weer te slepen.
- Niet naar het midden van de plaat slepen.
- U zou de vage inkepingen van uw streeplijn op het agar-oppervlak moeten kunnen zien.
- Met een steriele lus herhaalt u de procedure bij uw tweede streep.
- Met een steriele lus herhaalt u de procedure bij uw derde streep. Zigzag het laatste deel in het midden van de plaat.
- U zou ergens in uw laatste streep geïsoleerde kolonies moeten vinden.
- Als u een verbrandingsoven gebruikt, steriliseer dan uw lus. Als u plastic lussen gebruikt, gooit u de gebruikte lus in de cavicide-container.
- Plaats het deksel weer op uw plaat.
- Plaats uw voltooide platen met de agar-kant naar boven op het incubatierek op het voorste bureau in het incubatiegedeelte.
Figuur 1: Kwadrantmethode voor strepen voor isolatie.
Noten
- Het is absoluut noodzakelijk dat u uw lus tussen elke strepen steriliseert, hetzij door de verbrandingsoven te gebruiken, hetzij door een nieuwe steriele plastic lus te halen. Dit is de meest voorkomende fout die studenten maken.
- Laat je plaat niet te lang open of extra bacteriën uit de omgeving zullen in je plaat vallen.
- Wees niet teleurgesteld als je geen geïsoleerde kolonies krijgt bij je eerste poging. Dit is een moeilijke procedure.