Single-domain antibodies, of nanobodies, zijn onlangs in de schijnwerpers komen te staan als een potentiële behandeling voor COVID-19. In feite wordt een op COVID-19 gebaseerde behandeling op basis van nanobodies, ontwikkeld door de Beroni Group, een Australisch biotechnologiebedrijf, momenteel preklinisch getest. Hoewel nanobodies nu pas hun therapeutisch potentieel beginnen te realiseren, worden zij al tientallen jaren bestudeerd.
In 1989 ontdekten twee afgestudeerde studenten aan de Vrije Universiteit Brussel bij toeval een unieke eigenschap van kameelachtigen (kamelen, lama’s, en alpaca’s onder anderen). Bij het testen van ingevroren kameelbloedserum ontdekten de studenten dat kameelachtigen niet alleen conventionele antilichamen produceren, maar ook een unieke secundaire reeks van enkel-keten antilichamen (scAbs), bestaande uit twee identieke zware-keten polypeptiden, die elk twee aaneengesloten constante domeinen, een scharniergebied en een variabel domein bevatten. (De constante domeinen van elke zware keten lopen parallel; voorbij het scharniergebied divergeren de variabele domeinen als de armen van de letter “Y”). Elk van de variabele domeinen van het scAb dient als een antigeen-bindende module.
Deze opwindende ontdekking was nog maar het begin. Latere werkzaamheden toonden aan dat slechts een klein fragment van het scAb, een enkel variabel domein, nodig is om een antigeen te herkennen. Dit fragment weegt slechts 12-15 kDa, vandaar de naam “nanobody.”
In tegenstelling hiermee zijn menselijke antilichamen samengesteld uit twee identieke zware-keten en twee identieke lichte-keten polypeptiden. Deze eiwitten zijn groot, met een molecuulgewicht van ongeveer 150 kDa. In tegenstelling tot scAbs van kameelachtigen omspant de antigeenbindingsplaats van menselijke antilichamen zowel de zware als de lichte ketens (of liever de variabele domeinen van deze ketens), wat betekent dat alle ketens nodig zijn om een antigeen te detecteren.
Voordelen van nanobodies
Zoals menselijke antilichamen groot zijn, hebben zij vaak moeite om toegang te krijgen tot kleine bindingsruimten op virussen, bepaalde cellen, en doelwitten diep in tumorweefsel. De kleine nanobodies kunnen echter door nauwe ruimten navigeren en kunnen een aantrekkelijk alternatief zijn voor menselijke antilichamen voor therapeutische ontwikkelaars. Bovendien is het bindingsdomein van nanobodies lang, waardoor een “vingerachtige” structuur ontstaat die nanobodies beter in staat stelt hun doelwitten te bereiken.
Een groot voordeel van nanobodies, vergeleken met conventionele menselijke antilichamen, is hun gemakkelijke maakbaarheid. Het relatief eenvoudige proces begint met immunisatie van een kameel met het gewenste antigeen. Het immuunsysteem van de kameelachtige produceert een scAb dat het antigeen herkent. Vervolgens wordt een bloedmonster genomen van de kameelachtige (die verder ongedeerd blijft), en het mRNA voor het scAb wordt uit het monster geëxtraheerd.
De genen voor het variabele antigeen-bindende domein, dat wil zeggen, het nanobody, worden vervolgens uit het mRNA geamplificeerd. Grote hoeveelheden van het uiteindelijke nanobody kunnen dan tegen lage kosten worden geproduceerd in micro-organismen, meestal Escherichia coli.
Nieuwere methoden nemen dieren volledig uit de vergelijking door antigenen te testen tegen een vooraf geproduceerde bibliotheek van nanobodies. Twist Bioscience biedt via zijn divisie Twist BioPharma verschillende soorten nanobody-bibliotheken aan binnen een lama scAb-kader of een gedeeltelijk gehumaniseerd scAb-kader. Miljarden nanobody-sequenties kunnen in één keer worden getest, waardoor de ontdekking en ontwikkeling van antilichamen uiterst snel en relatief goedkoop is.
Nanobody-toepassingen
Oorspronkelijk werden nanobodies alleen of hoofdzakelijk voor onderzoeksdoeleinden gebruikt. Het onderzoek naar het gebruik van nanobodies als therapeuticum is de afgelopen tien jaar echter drastisch toegenomen. In februari 2019 werd een belangrijke vooruitgang geboekt toen het eerste nanobody-therapeuticum werd goedgekeurd door de FDA.
Het medicijn, Cablivi genaamd, werd ontwikkeld door Ablynx voor de behandeling van verworven trombotische trombocytopenische purpura. Cablivi werkt als een anti-Von Williebrand-factor en voorkomt dat bloedplaatjes zich rond organen samenvoegen.
Nanobodies voor uiteenlopende aandoeningen zijn in klinische proeven. Zo worden nanobodies geëvalueerd als behandelingen voor psoriasis, reumatoïde artritis en virale infecties.
Nanobodies vormen niet alleen solotherapieën, maar kunnen ook bijdragen aan combinatietherapieën. Van belang zijn de klinische proeven waarin de combinatie van nanobodies en chimere antigen receptor (CAR) T-celtherapieën voor kanker wordt onderzocht.
CAR T-cellen zijn genetisch gemanipuleerd om antigenen op het oppervlak van tumoren te herkennen en aan te pakken. Tot nu toe zijn CAR T-celtherapieën veelbelovende behandelingen gebleken voor bloedkankers die niet reageren op meer conventionele behandelingen. CAR T-celtherapieën zijn echter nog niet succesvol geweest tegen solide tumoren.
Om solide tumoren aan te pakken, moeten CAR T-cellen zich wellicht richten op alternatieve doelwitten. De gebruikelijke doelwitten zijn kankerspecifieke antigenen, die moeilijk te vinden blijken te zijn, en kankergeassocieerde antigenen, die gemakkelijker te vinden zijn, maar moeilijker op een veilige manier te gebruiken zijn, omdat ze ook op gezonde cellen voorkomen.
Deze doelwitten leveren nog een andere moeilijkheid op. Zij worden gewoonlijk bestreden door CAR T-cellen die een antigeenherkenningsdomein bevatten dat is afgeleid van een menselijk monoklonaal antilichaam. Menselijke antilichamen kunnen echter immunogeniciteit veroorzaken, wat leidt tot bijwerkingen en een vermindering van de werkzaamheid van CAR T-cellen.
Welke alternatieve doelwitten zouden geschikt kunnen zijn? Mogelijkheden in overvloed in de extracellulaire matrix, een web van eiwitten dat solide tumoren afschermt en immunosuppressieve moleculen herbergt. Het idee om doelwitten in de extracellulaire matrix te raken, sprak wetenschappers van het Boston Children’s Hospital aan. Uiteindelijk besloten deze wetenschappers CAR T-cellen te ontwikkelen met antigeen-herkenningsdomeinen afgeleid van nanobodies.
Met behulp van muismodellen van kanker toonden de wetenschappers aan dat op nanobodies gebaseerde CAR T-cellen slechts zwak immunogeen zijn en in staat zijn om specifieke antigenen in de tumormicro-omgeving te herkennen. Om deze CAR T-cellen te construeren, gebruikten de wetenschappers de Gibson-assemblagemethode, een techniek waarmee meerdere DNA-fragmenten kunnen worden gecombineerd en gekloond.
CAR T-cel-nanobody-constructen zijn in staat om tumorvoedende bloedvaten en tumorbeschermende elementen van de extracellulaire matrix te beschadigen. De schade aan de tumormicro-omgeving vertraagt de groei aanzienlijk en geeft andere behandelingen, zoals chemotherapie, toegang tot de binnenkant van de tumor.
Nanobody-ontwikkelingsproblemen
Het duurde 30 jaar nadat nanobodies in 1989 werden ontdekt voordat een nanobody-therapeuticum de markt bereikte. De eerste 10 jaar waren gericht op onderzoek naar de structuur, samenstelling en eigenschappen van nanobodies. Net na het verstrijken van de termijn van 10 jaar, in 2001, probeerde de Vrije Universiteit Brussel nanobodies te commercialiseren met meerdere octrooien op haar naam. Deze octrooien werden vervolgens overgedragen aan het Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB) en vervolgens aan een door het VIB opgericht bedrijf, Ablynx, in 2002.
Het is waarschijnlijk dat de beperkingen van de intellectuele eigendom op de samenstelling van nanobodies hebben bijgedragen aan de lange vertraging tussen de ontdekking van nanobodies en de eerste goedkeuring van een geneesmiddel op basis van nanobodies. De belangrijkste octrooiaanspraken op deze biomolecule liepen echter af in 2014 in Europa en 2017 in Amerika, waardoor Ablynx haar samenwerking met enkele van de grootste farmaceutische bedrijven ter wereld, waaronder Merck & Co, Boehringer Ingelheim, en Sanofi, aanzienlijk kon uitbreiden.
Deze samenwerkingen hebben geresulteerd in een vlaag van klinische studies die zijn geregistreerd met nanobodies en de langverwachte goedkeuring van Cablivi. Bovendien heeft de vermindering van de intellectuele eigendomsbelemmeringen in verband met de samenstelling van nanobodies nog meer bedrijven in staat gesteld belangstelling te tonen voor de verdere commercialisering van deze supermoleculen.
Zoals alle therapieën hebben ook nanobodies nadelen. Hun geringe omvang leidt tot een snelle klaring door de nieren, waardoor hun halfwaardetijd korter wordt. Om ervoor te zorgen dat er voldoende nanobodies in het bloed aanwezig zijn om het gewenste effect te bereiken, is frequente toediening nodig, wat niertoxiciteit kan veroorzaken. Ook bestaat er een klein risico dat patiënten een immuunrespons krijgen op therapeutische nanobodies, aangezien het om biologisch materiaal gaat.
Gelukkig genoeg kunnen deze problemen worden overwonnen. Uit onderzoek is gebleken dat het fuseren van nanobodies met serumalbumine, een overvloedig transporteiwit in het bloed, de halfwaardetijd van nanobodies aanzienlijk verlengt, waardoor ze langer en in grotere hoeveelheden in het bloed kunnen blijven. De immunogeniciteit van nanobodies kan worden verminderd door humanisering, een proces waarbij sommige nanobody-eiwitsequenties worden gewijzigd om hun gelijkenis met menselijke antilichamen te vergroten, waardoor het risico van een negatieve immuunreactie wordt verminderd.
Hoewel de commercialisering van nanobodies als therapeutica vertraging heeft opgelopen, wordt verwacht dat, nu meerdere bedrijven in deze prachtige en unieke moleculen kunnen investeren, er binnenkort een explosie van nanobodies zal zijn die als therapeutica voor een veelheid van ziekten worden gebruikt, van virale infecties tot kanker. Camelid nanobodies hebben niet alleen hun waarde bewezen, maar zouden ook het landschap van antilichaamtherapie kunnen veranderen en een nieuwe generatie van therapeutica kunnen inluiden.