Cellulaire en moleculaire reacties op acute behandeling met cocaïne in neuronaal-achtige N2a-cellen: potential mechanism for its resistance in cell death

Materials

Cell culture

De N2a cellen (CCL-131, ATCC) werden onderhouden als een monolayer cultuur48, en is op grote schaal gebruikt voor studies naar stoffen van misbruik14,49,50 of CNS-aandoeningen zoals Parkinson51 of de ziekte van Alzheimer47,52,53. Een voordeel van deze cellijn is dat de fijne morfologische veranderingen als gevolg van een chemische blootstelling gemakkelijk kan worden gedetecteerd op grond van hun grotere celgrootte. Tenzij anders vermeld, werden alle experimenten in onze studie uitgevoerd in fenolroodvrij RPMI-1640 medium dat 10% FBS bevat. Nagezaaide cellen in kweekplaten of schotels mochten 4-5 dagen groeien in de incubator voor spontane differentiatie van neurietuitgroeisels. Alle studies werden ten minste tweemaal herhaald.

Morfologie

Voor bruto celmorfologische evaluaties werden met kristalviolet gekleurde cellen37 gefotomicrografeerd met EVOS Cell Imaging Systems met ×40 objectief. In sommige studies, werden morfologie of vacuolen van kristalviolet-gekleurde cellen genomen met behulp van een omgekeerde fasecontrast IX-70 Olympus microscoop. Neurite uitgroeisels werden gekwantificeerd met behulp van image J software (National Institutes of Health).

Electrofysiologie

Whole-cell patch clamp werd gebruikt om op te nemen van N2a cellen gekweekt op plastic dekglaasjes. Cover slips werden drie keer gewassen met extracellulaire opname-oplossing met (in mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glucose, en 10 HEPES (312 mOsm, pH 7,4) en werden geïncubeerd in deze oplossing bij kamertemperatuur. Cover slips werden ofwel onbehandeld gelaten of behandeld met 6,25 uM of 4 mM cocaïne direct in de extracellulaire oplossing tijdens de opname. Glazen elektroden (weerstand 1-5 MΩ) werden gevuld met intracellulaire oplossing met (in mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES, en 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4). Cellen werden gevisualiseerd onder fasecontrast met een Nikon Eclipse Ti-U omgekeerde microscoop en aangesloten DS-Qi1 monochrome digitale camera.

Records werden gemaakt met een Axopatch 200B versterker (Molecular Devices, CA) en gedigitaliseerd met een Digidata 1440A systeem (Molecular Devices, CA). Ionische stromen werden opgenomen onder een spanning klem protocol (-60 tot 135 mV in 15 mV stappen, 250 ms in duur). Spontane postsynaptische stromen werden opgenomen onder continue spanningsklem bij -80 mV gedurende 2 min. Een stroomtang protocol (-100 tot 200 pA in 20 pA stappen, 800 ms in duur) werd gebruikt om het vermogen van N2a cellen om actie potentialen in reactie op de huidige injectie vuur te beoordelen. Signalen werden gefilterd op 1 kHz en bemonsterd op 10 kHz. Gegevens werden verzameld en geanalyseerd met behulp van pCLAMP 10 software (Molecular Devices, CA).

Behandelingen

Een bekende hoeveelheid cocaïnehydrochloride werd opgelost in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) als 1 M voorraad vlak voor de assays. Om in vivo farmacologische concentraties van cocaïne, variërend van 1 nM tot 6,25 uM simuleren, werden verschillende werkvoorraden (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200 en 400 uM) bereid in PBS, op dezelfde manier, voor hogere cocaïne concentraties (2, 3 en 4 mM eind), werden werkvoorraden van 80, 120 en 160 mM bereid in PBS. Van elke werkvoorraad werd 5 ul cocaïne per putje toegevoegd om de gewenste concentraties te bereiken en om pH-veranderingen in het kweekmedium te voorkomen37. Eindvolume in elk putje was 200 ul. Terwijl de selectie van lagere concentraties was gebaseerd op de verslagen van nano tot lagere micro molar cocaïne in CNS-cellen van verslaafden 13, de hogere concentraties waren gebaseerd op verschillende in vitro studies 14,15,16. Cellen met alleen medium of een gelijk volume van het voertuig (PBS) in het medium dienden als controles, terwijl medium verstoken van cellen werd genomen als een blanco. Op basis van onze eerdere studies in C6 astroglia-achtige cellen 6, werden cocaïne behandelingen in de huidige studie ook uitgevoerd gedurende 1 uur voor vergelijkingsdoeleinden. Overigens, cocaïne effect in verslaafden slijt binnen deze periode voor typische hoeveelheden en routes van inname33. In een subset van experimenten werden de cellen in 96-wells platen voorbehandeld met 1 µM YM155, een remmer van het survivin-gen, gedurende 30 min, gevolgd door cocaïne (2-4 mM) co-behandeling gedurende 1 uur en geëvalueerd op levensvatbaarheid van de cellen, terwijl in andere studies de cellen werden voorbehandeld met 5 μM PIK-75, een remmer van Nrf-224, gedurende 30 min voorafgaand aan cocaïne co-behandeling (2-4 mM) gedurende 1 uur en geëvalueerd op levensvatbaarheid van de cellen en GSH-niveaus.

Levensvatbaarheid en vacuolatie

Cel levensvatbaarheid werd beoordeeld door kristalviolet kleurstof-opname zoals eerder beschreven54,55. De mate van vacuolatie in de cellen werd gekwantificeerd in glutaaraldehyde gefixeerde cellen door neutrale rode kleurstofopname zoals eerder beschreven56. De kleurstof werd geëxtraheerd met 70% ethanol en 0,37% zoutzuur, en de extinctie bij 540 nm werd gemeten in een plaatlezer. Kristalviolet gekleurde cellen werden gebruikt voor fotomicrografie van vacuolen met behulp van een omgekeerde fase contrast IX-70 Olympus microscoop met een × 40 objectief.

Video microscopie

Voor live videografie, werd een van de oculaire lenzen van de omgekeerde fase contrast IX-70 Olympus microscoop vervangen door een standaard oculaire video-camera systeem. De uitgang van de video-connector werd aangesloten op een computer voor beeld visualisatie op de monitor met behulp van de Electronic Ocular -R-AMCap software programma, geleverd door Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co, Ltd, (HangZhou, China). Video documentatie werd genomen met een snelheid 14 frames per seconde.

Cell membraan integriteit assay

Cell membraan integriteit werd bepaald door het meten van de afgifte van cytoplasmatische LDH met CytoTox 96 niet-radioactieve assay kit (Promega, Madison, WI) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden de cellen in 96-well microtiterplaten behandeld met verschillende concentraties cocaïne (2, 3 en 4 mM) gedurende 1 uur. Vervolgens werd 50 ul testmedium overgebracht in een nieuwe 96-well plaat, gemengd met een gelijk volume substraatmix uit de kit, en gedurende 30 min geïncubeerd bij 37 °C. De absorptie werd gemeten in een plaatlezer bij 490 nm.

Meting van intracellulaire ROS

Cellen in 96-wells-platen werden gedurende 1 uur behandeld met cocaïne van 2, 3 en 4 mM, gevolgd door kleuring met een celpermeabele kleurstof H2DCFDA (10 μM definitief) gedurende 30 min6. Na voorzichtig wassen en drogen van de cellen aan de lucht, werd PBS (100 ul / putje) toegevoegd. De platen werden afgelezen met het excitatiefilter ingesteld op 485 nm en het emissiefilter op 530 nm in een automatische lezer (BioTek™ Synergy HTX multimode micro plate reader, BioTek Instruments, Winooski, VT).

Lipid peroxidation assay

Cellen werden uitgezaaid bij een begindichtheid van 0,3 × 106 cellen per putje in platen met zes putjes. Lipide peroxidatie werd gemeten zoals eerder beschreven57. In het kort: na behandeling met cocaïne van 2, 3 en 4 mM gedurende 1 uur werden de cellen geoogst en bij 13.000 rpm in een tafelmodel microcentrifuge gecentrifugeerd gedurende 6 min. Alle celpellets werden gedurende 3 s in PBS op ijs gesonificeerd en overgebracht in glazen buisjes. Vervolgens werden de lysaten gemengd met 30% trichloorazijnzuur en 0,37% thiobarbituurzuur (TBA). Het mengsel werd gedurende 10 min gekookt, afgekoeld tot kamertemperatuur (RT), overgebracht in nieuwe falconbuizen en gecentrifugeerd bij 3038 × g gedurende 10 min. Het heldere supernatant werd overgebracht in een 96-well-plaat en de extinctie bij 535 nm werd gemeten in een microplaatlezer. Helder medium zonder cellen werd gebruikt als blanco.

Algemene mitochondriale metabolische activiteit en membraanpotentiaal

Cellen (2 × 104) werden behandeld met verschillende concentraties cocaïne (2, 3, en 4 mM) gedurende 1 uur in 96-well microtiterplaten. Vervolgens werden de platen gecentrifugeerd bij 304 × g gedurende 4 min, en het cocaïnebevattende medium werd zorgvuldig weggegooid. Nadat onmiddellijk vers medium aan de cellen was toegevoegd (200 μl), werd 10 μl MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethonyfenol)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium, Promega) per putje toegevoegd zoals eerder gerapporteerd58 en gedurende 30 min. geïncubeerd bij 37 °C. De absorptie werd in een microtiterplaatlezer bij 490 nm gemeten. De membraanpotentiaal werd bepaald volgens de eerder beschreven procedure46. Aan het einde van 1 uur behandeling met cocaïne, werden de monolaag cellen overgoten met 100 ul van 0,25% waterige glutaaraldehyde voor fixatie, met Rh 123 tot een eindconcentratie van 2,6 uM gedurende 30 min bij RT. Het supernatant werd weggegooid, en de platen werden gewassen met water en aan de lucht gedroogd in de kap. Ten slotte werd per putje 100 μl 0,1% Triton×100 in PBS toegevoegd en gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd. De platen werden afgelezen met het excitatiefilter ingesteld op 485 nm en het emissiefilter op 538 nm op een BioTek™ Synergy™ HTX-multimodus microplaatlezer.

Lactaatdetectie

Studies uitgevoerd op cellen gekweekt in medium met 10% FBS gaven hoge achtergrondwaarden als gevolg van interactie van serum met sommige van de kitcomponenten (Trinity Biotech, Jamestown, NY). Daarom werd in onze latere studies, voorafgaand aan de behandelingen, 10% FBS bevattend medium vervangen door gereduceerd serum (0,1% FBS) in 96-well microtiterplaten (2 × 104 cellen per well). De kit reagens werd opgelost in chromogene oplossing die bestond uit 5,3 mM vanillezuur, 2,9 mM 4-amino antipyrine, en ongeveer 4 eenheden van mierikswortelperoxidase. Aan het einde van 1 uur cocaïne behandeling, werd de kit reagens direct toegevoegd aan de putjes (20 ul per 200 pi) en de platen werden gehouden in de incubator bij 37 ° C voor kleurontwikkeling (5-10 min). De absorptie van de onbehandelde cellen werd als controle genomen, terwijl het medium zonder cellen als blanco werd gebruikt. De absorptie werd gemeten bij 490 nm in een microplaatlezer.

NMR spectroscopie

Lactaat-afgifte uit de cellen werd gedetecteerd door proton (1H+) NMR spectroscopie. Aangezien de hoeveelheid serum niet interfereert in deze methode, gebruikten we 10% FBS in medium in 96-well microtiterplaten (2 × 104 cellen/200 pi per putje). Aan het einde van 1 h cocaïne behandeling, medium (0,15 ml per putje) van alle replicaten (n = 12) van elke behandeling werd gepoold (1,8 ml) in de gelabelde buizen. Medium van de onbehandelde cellen werd gebruikt als controle. Omdat de behandelde monsters 2-4 mM cocaïne bevatten, voegden we cocaïne (4 mM definitief) toe aan de blanco media. NMR-analyses werden uitgevoerd op Bruker Avance 800 (= 800,23 MHz) die is uitgerust met een TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z cryoprobe (de maximale z-veld gradiënt sterkte is 48 G / cm). Voor het verkrijgen van een ééndimensionaal (1D) NMR-spectrum werden 16 transiënten verkregen en samengevoegd met een acquisitievertraging van 3 s. Datapunten (32.000) werden gebruikt voor het verkrijgen van een spectrale breedte van 7500 Hz. De dominante waterpiek bij 4,75 ppm in het spectrum werd geëlimineerd met behulp van de WATERGATE W5 pulssequentie20. Een bandbreedte van 3000 Hz langs elke kant van de waterpiek werd gegeven als een spectrale venster voor het observeren van opgeloste pieken door het gebruik van een vertragingstijd van 333.3 u voor de WATERGATE puls treinen. Een externe standaard, 3,3 mM waterige DMSO-oplossing, werd bereid voor de kwantificering van het lactaat in de monsteroplossing.

Meting van H2S in celkweekmedium

Cellen werden gezaaid bij een begindichtheid van 2 × 104 per putje in 96-well platen. Voorafgaand aan de cocaïnebehandeling werd 1,64% waterig zinkacetaat59,60 (definitief: 0,041%) aan de cellen toegevoegd om vluchtig H2S-gas om te zetten in zinksulfide tijdens de cocaïnebehandeling. Na 1 uur behandeling met 2, 3 en 4 mM cocaïne werden 17,453 mM N,N-dimethyl-p-fenyleendiaminesulfaat in 7,2 M HCl (eind: 2,55 mM) en 26,18 mM FeCl3 in 1,2 M HCl (eind: 3,83 mM) aan de putjes toegevoegd en voorzichtig geveerd. Belletjes in het medium werden verwijderd door 5 μl koude ethanol toe te voegen aan alle putjes, net voor het aflezen van de platen bij 670 nm in een microplaatlezer.

ATP bioluminescentie assay

Cellen in 96-well microtiterplaten werden gedurende 1 uur behandeld met verschillende concentraties cocaïne (2, 3 en 4 mM). Totaal ATP werd gemeten met behulp van de Bioluminescent ATP Somatic cell assay kit (FLASC, Sigma-Aldrich) volgens de door de fabrikant geleverde kitinstructies. In het kort werd aan het eind van de behandeling 75 pi Somatic Cell ATP releasing solution per well toegevoegd om de cellen te lyseren. Vervolgens werd 50 μl lysaat overgebracht in nieuwe witte 96-wells-platen met doorzichtige bodem, die reeds 50 μl ATP assay-mix enzym bij gereduceerd licht bevatten. De luminescentie werd onmiddellijk gemeten op een BioTek™ Synergy™ HTX multi-mode microplaatlezer.

Ontdekking van RNA en cDNA-synthese

De cellen werden gezaaid bij een dichtheid van 2 × 106 in kweekschaaltjes met een diameter van 100 mm. Op het moment van behandeling bereikten de cellen ongeveer 65-70% confluentie. Na 1 uur behandeling met 2-4 mM cocaïne, werden de cellen geoogst door schrapen en gecentrifugeerd bij 1125 × g gedurende 5 minuten. Totaal RNA werd geïsoleerd volgens het protocol geleverd door de fabrikant (Qiagen Sciences, German town, MD) met behulp van RNeasy mini spin kolommen. DNase I (Qiagen Sciences) behandeling werd uitgevoerd op de kolom. Totaal RNA uit de kolom werd geëlueerd met 20 pi RNase vrij water. Ten behoeve van de kwantificering werd het RNA op ijs verdund in RNase vrij water in een verhouding van 1:10. De hoeveelheid totaal RNA werd gemeten met de Nanodrop ND-1000 spectrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Het RNA vertoonde een verhouding van >1,95 bij 260/280 nm, en werd vervolgens gebruikt voor cDNA synthese. Eén microgram totaal RNA werd gebruikt voor de productie van cDNA met behulp van een iScript cDNA synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) volgens de instructies van de fabrikant.

Relatieve expressie door kwantitatieve RT-PCR

Genexpressie-analyse van Nrf-2, survivin (Birc5), en GAPDH door qPCR werd uitgevoerd in een iCycler thermische cycler met MyiQ detectiesysteem (Bio-Rad) met behulp van iQ SYBR Green supermix. Nrf-2, survivin, en GAPDH producten werden gesynthetiseerd door afzonderlijke PCR-reacties, uitgevoerd in 20 ul eindvolume met 2 ul van cDNA monster en 500 nM van specifieke primers. De cyclische omstandigheden waren als volgt: 95 °C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s, terwijl de smeltcurveanalyse na de PCR werd uitgevoerd bij 55-95 °C. De relatieve kwantificering van genexpressies werd uitgevoerd volgens de 2-△△CT-methode61 met GAPDH als endogene controle. De voor de analyses gebruikte primersequenties worden weergegeven in tabel 1.

Totale GSH-assay

Na behandeling met verschillende concentraties cocaïne (2-4 mM) in volledig medium gedurende 1 uur in 96-well microtiterplaten, werden de cellen gefixeerd met 0,25% glutaaraldehyde gedurende 30 min, gevolgd door driemaal voorzichtig wassen, en aan de lucht gedroogd. Het totale cellulaire GSH werd bepaald zoals eerder beschreven62. De absorptie werd gemeten bij 412 nm in een microtiterplaatlezer.

Voorbereiding van hele-cellysaten

Voor enzymatests werden cellen uitgezaaid bij een dichtheid van 2 × 106 in kweekschaaltjes met een diameter van 100 mm. Na 1 uur behandeling met 2-4 mM cocaïne, werden de cellen geoogst met behulp van celschrapers. Na centrifugatie bij 1620 × g gedurende 5 min, werden de celpellets opgeslagen bij -70 ° C tot verder gebruik. Op de dag van de tests werden de pellets geresuspendeerd in 0,5 ml PBS en tweemaal gedurende 15 s op ijs gesonificeerd. De inhoud werd overgebracht in eppendorfbuisjes en gedurende 5 min. bij 5000 rpm gemicrocentrifugeerd. De supernatanten werden overgebracht in nieuwe buisjes en gebruikt voor enzymtests. Eiwitconcentratie in elk lysaat werd bepaald met behulp van BCA eiwit assay kit (Pierce, Rockford, IL) volgens de instructies van de fabrikant met boviene serumalbumine als standaard reference.

Catalase assay

Het werd geanalyseerd volgens de eerdere methode63. Het reactiemengsel (450 μl) in een kwarts cuvet bevatte 50 μl cellysaat (60 μg), 250 μl 50 mM fosfaatbuffer (pH 7,0). De reactie werd gestart door toevoeging van 150 μl van 30 mM H2O2 (10 mM definitief). De afname van de absorptie bij 240 nm werd gedurende 2 min gevolgd in een Genesys 10 S UV-Vis spectrofotometer (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). De enzymactiviteit werd berekend met behulp van de extinctiecoëfficiënt van 0,00706 per mmol per mm en de eenheid van enzymactiviteit werd uitgedrukt als mmol H2O2 die per minuut per mg eiwit wordt afgebroken. Vervolgens werd de enzymactiviteit van de behandelde monsters vergeleken met de controle (100%).

GPx assay

Het werd geanalyseerd volgens de gepubliceerde procedure64. Het reactiemengsel (500 pi) bevatte 1 mM GSH, 0,15 mM NADPH, 0,12 eenheid glutathionreductase (GR), 0,1 mM natriumazide in 0,1 M kaliumfosfaat (pH 7,0 met 1 mM EDTA. Natriumazide werd aan het reactiemengsel toegevoegd om de endogene katalaseactiviteit te remmen. Het reactiemengsel werd geïncubeerd met 60 ug monster gedurende 10 min zonder NADPH, en de reactie werd gestart door de toevoeging van NADPH en H2O2 in een eindconcentratie van 150 uM. De snelheid van het NADPH-verbruik werd gedurende 3 minuten bij 340 nm gevolgd. Een eenheid GPx-activiteit werd gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om 1 μmol NADPH/min in de gekoppelde test te verbruiken en de activiteit werd uitgedrukt per mg eiwit. Vervolgens werd de enzymactiviteit van de behandelde monsters vergeleken met de controle (100%).

Statistische analyse

De experimentele resultaten (n = aantal putjes gepoold uit ten minste twee verschillende experimenten) werden gepresenteerd als het gemiddelde ± SEM. Alle staafdiagrammen werden uitgezet met GraphPad Prism Software, versie 3.00 (San Diego, CA). De gegevens werden geanalyseerd op significantie door middel van een eenweg ANOVA en vervolgens vergeleken met behulp van Dunnett’s of Bonferroni’s meervoudige vergelijkingstests. De testwaarden van P < 0,05 en P < 0,01 werden beschouwd als significant en zeer significant, respectievelijk.