Clinical and Genetic Heterogeneity of the 15q13.3 Microdeletion Syndrome

Abstract

De 15q13.3 microdeletie is een recurrente CNV, vermoedelijk gemedieerd door NAHR tussen segmentale duplicaties in chromosoom 15. De 15q13.3 deletie en duplicatie zijn geassocieerd met een breed scala aan klinische manifestaties, zoals intellectuele stoornissen, epileptische aanvallen, autisme, taal- en ontwikkelingsachterstand, neuropsychiatrische stoornissen, en gedragsproblemen die een onvolledige penetrantie en expressiviteit illustreren. Deze studie omvat een evaluatie van 106 symptomatische patiënten met de heterozygote deletie, evenals van 21 patiënten met de duplicatie, die in eerdere studies zijn beschreven. De analyse toont een aanzienlijke heterogeniteit voor wat betreft de manifestatie van verschillende belangrijke symptomen en het bekende voorkomen. Bovendien worden 8 nieuwe patiënten voorgesteld. Verdubbelde bekende verbanden geven nieuwe inzichten in de complexiteit van symptomatische manifestatie. In eerdere studies zijn verschillende meningen geuit over de aard en precieze locatie van de deletie breekpunten. Hier tonen we aan dat niet CHRNA7 en CHRFAM7A, maar eerder FAM7A of GOLGA8, dienen als breekpuntregio’s betreffende onze patiënten. De deletie wordt beschreven als heterogeen in grootte. Wij nemen echter aan dat niet alleen verschillende breekpunten, maar ook de onnauwkeurigheid van aCGH-analyse op chromosoom 15 als gevolg van segmentale duplicaties de oorzaak is van de variabiliteit in grootte.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Het 15q13.3 microdeletie syndroom (OMIM 612002), dat voor het eerst is beschreven door Sharp et al. , is een recurrente CNV, vermoedelijk gemedieerd door NAHR tussen segmentale duplicaties (BP3-BP5, BP4-BP5) in chromosoom 15. De 15q13.3 deletie en duplicatie zijn geassocieerd met een breed scala van neurologische ontwikkelingsstoornissen, zoals intellectuele stoornissen, epileptische aanvallen, autisme, taal- en ontwikkelingsachterstand, neuropsychiatrische stoornissen, en gedragsproblemen met onvolledige penetrantie en variabele expressiviteit. De typische 1,6-Mb deletie bevat 7 genen: ARHGAP11B, MTMR10, MTMR 15, TRPM1, KLF13, OTUD7A, en CHRNA7. CHRNA7 codeert voor de neuronale alpha7 nicotine acetylcholine receptor en wordt daarom beschouwd als het belangrijkste kandidaat-gen dat verantwoordelijk is voor de tot uitdrukking gebrachte klinische kenmerken.

In deze studie beschrijven we 6 tot nu toe ongepubliceerde patiënten die de typische 15q13.3 microdeletie tussen BP4 en BP5 dragen, waaronder een familie met 4 getroffen leden die hieronder verder worden beschreven. Daarnaast worden 1 patiënt met een 15q13.3 duplicatie en 1 patiënt met een 3.4-Mb deletie tussen BP3 en BP5 beschreven.

Om de verscheidenheid aan klinische verschijnselen en de ernst van de symptomen te verklaren, hebben we bovendien de gegevens van 106 symptomatische patiënten met een heterozygote 15q13.3 deletie en 21 patiënten met een heterozygote 15q13.3 deletie en 21 patiënten met een deletie van 3.4-Mb tussen BP3 en BP5 bekeken.3 deletie en 21 patiënten met duplicaties die zijn gerapporteerd.

In recente studies zijn verschillende meningen gerezen over de aard en de precieze plaats van de deletie breekpunten. Wij onderzochten de plaats van de breukpunten met behulp van FISH om te bevestigen in hoeverre deze opties juist blijken te zijn voor onze patiënten.

Methoden

DNA-extractie en Array-CGH

Perifere bloedleukocyten werden gebruikt als bron van DNA. Array-CGH-analyse werd uitgevoerd met een array-slede Sure Print 4x180K (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., VS). Patiënten-DNA werd gelabeld met Cy3, referentie-DNA met Cy5. De hybridisatie werd uitgevoerd met Cot-1 DNA (1,0 µg/ml). Test-DNA-monsters werden gehybridiseerd met geslachtsgematcht referentie-DNA (Agilent). De zuiverings-, hybridisatie- en wasstappen werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Sure Scan microarray Scanner G2600D (Agilent), Feature Extraction software (Agilent) en Agilent Cytogenomics Software Edition 2.0.6.0 werden gebruikt.

FISH and Breakpoint Analysis

Glaasjes met metafasen van gekweekte perifere lymfocyten werden bewaard bij -70°C. Vóór de hybridisatie werden de objectglaasjes behandeld in een alcoholreeks (70, 80 en 100%), gevolgd door een pepsinebehandeling (15 min, 37°C). Fluorescentie-gelabelde BACs (Illumina®, BlueFish) werden gebruikt als FISH probes. De probepreparatie, hybridisatie en wasstappen werden uitgevoerd volgens de instructies van Illumina.

De gebruikte BAC-probes waren RP11-11H9, 22.067.176-22.300.706, chr.15q11.2; RP11-40J8, 30.546.758-30.724.265, chr.15q13.2; RP11-348B17, 31.281.641-31.502.115, chr.15q.13.3; RP11-265I17, 32.293.149-32.457.541, chr.15q13.3; RP11-280K19, 32.654.212-32.821.799, chr.15q13.3, en RP11-232J12, 53.792.861-53.948.902, chr.15q21.3 (zie fig. 1, hg19).

Resultaten

Clinische beoordeling

De patiënten werden aanvankelijk geobserveerd bij neuropediatrisch onderzoek wegens intellectuele stoornissen en/of ontwikkelingsachterstand. Tabel 1 geeft een overzicht van de cytogenetische en klinische bevindingen.

Beschrijving van patiënten

Patiënt 1 (III/1)

Het 13-jarige meisje presenteerde zich met aandachtstekortstoornis met hyperactiviteit (ADHD), intellectuele achterstand, ontwikkelingsachterstand, recidiverende luchtweginfecties, en scoliose. Haar gewicht en hoofdomtrek (OFC) schommelen rond het 10e percentiel (P), respectievelijk P90. Ze gaat naar een speciale school. Haar moeder (II/2, in fig. 2) ging ook naar een school voor speciaal onderwijs en heeft die met succes doorlopen. Beide ouders zijn niet beschikbaar voor verder onderzoek. Patiënt 1 is een halfzus van patiënten 2 en 3, en de neef van patiënt 4.

Patiënt 2 (III/2)

De vrouwelijke patiënte werd geïntroduceerd op de leeftijd van 9 jaar en vertoonde een ontwikkelings- en taalachterstand, evenals intellectuele tekortkomingen (K-ABC-Test: IQ 63). Een wakend EEG toonde algemene veranderingen, maar tot nu toe hebben zich geen aanvallen voorgedaan. Haar OFC is tussen P3 en P10, gewicht en lengte zijn in normale waarden. ADHD wordt behandeld met methylfenidaat. Ze wordt beschreven als een vrolijk maar ook agressief en impulsief persoon en gaat naar een speciale school. Beide ouders zijn niet beschikbaar geweest voor verder onderzoek.

Patiënt 3 (III/3)

Bij de 10-jarige patiënte werd een leerstoornis vastgesteld, die niet nader werd omschreven. De lichaamsmaten van het meisje vertonen een grote variatie in de tijd. Tot de leeftijd van 2 jaar was haar OFC P<3; momenteel is haar gewicht P97. Ze is zwaarlijvig, vertoont stereotiep gedrag en gaat naar een speciale school.

Patiënt 4 (III/6)

Bij het onderzoek van de patiënte (13 jaar) werden taal- en psychomotorische achterstand evenals milde intellectuele tekorten (HAWIK-IV: SW 56) vastgesteld. Opvallende kenmerken zijn meervoudige dyslalie en ADHD, die wordt behandeld met methylfenidaat (10-15 mg/dag). Het EEG van de jongen is onopvallend, zijn OFC is normaal, zijn lengte P90, en zijn gewicht P97. Het karakter van de patiënt wordt omschreven als vriendelijk, maar soms agressief en impulsief. Hij gaat naar een school voor gehandicapten. Beide ouders gingen naar een speciale school. Zijn vader (II/5) zit in de gevangenis wegens mishandeling. Zijn 2 zussen (III/7, III/8) gaan ook naar een speciale school, en zijn halfbroer (III/9) vertoont een achterstand in ontwikkeling en taal, maar draagt de deletie niet. De patiënt is de neef van de patiënten 1, 2 en 3. De ouders zijn niet beschikbaar geweest voor onderzoek.

Patiënt 5

De patiënt (14 jaar oud) presenteerde zich met abnormaal sociaal gedrag en ADHD. Vanwege zijn slechte schoolprestaties en de discrepantie tussen zijn intellectuele prestaties (HAMIK-IV, IQ 78) en het gemiddelde van de familie, werd een medisch onderzoek ingesteld. Na een epileptische aanval is hij met succes behandeld met Orfiril®. ADHD wordt behandeld met methylfenidaat (5-10 mg/dag). Zijn ouders zijn niet beschikbaar geweest voor onderzoek.

Patiënt 6

Als zuigeling vertoonde patiënt 6 een ontwikkelings- en taalachterstand. Hij vertoonde tekenen van hypotonie. Op het moment van onderzoek, presenteerde de 19-jarige patiënt zich met intellectuele tekortkomingen en ADHD. De behandeling met methylfenidaat werd gestopt nadat de patiënt was begonnen met topsport, wat een effectieve behandeling van de ADHD-symptomen bleek te zijn. Zijn moeder is geen deletie draagster. Zijn vader is niet beschikbaar geweest voor onderzoek.

Patiënt 7

De patiënt werd op 7-jarige leeftijd onderzocht en vertoonde milde intellectuele tekorten (K-ABC-Test, SW: 63). Zijn lichaamsmaten zijn allemaal binnen P10. Hij wordt beschreven als onrustig en onoplettend. Hij gaat naar een speciale school. Zijn ouders zijn niet beschikbaar voor onderzoek.

Patiënt 8

De patiënt is geboren met een hartafwijking (ventrikelseptumdefect en atriumseptumdefect). Hij vertoont dysmorfe kenmerken zoals laag aangezette oren, hypertelorisme, strabisme, en hypotonie. Zijn psychomotorische ontwikkeling is vertraagd. De patiënt’s geboorte lengte en OFC waren P50, zijn gewicht was P10. Hij erfde de duplicatie van zijn vader die een onopvallend fenotype vertoont. Een oom (op de maternale plaats) met epilepsie en maligne hyperthermie is gemeld.

Breakpoint Analyse

In eerdere studies is de heterogeniteit van de deletiegrootte een onderwerp van belangstelling geweest. Shinawi et al. veronderstelden dat FAM7A1/2 als breekpunt fungeerde, terwijl Szafranski et al. CHRNA7 en CHRFAM7A ervan verdachten verantwoordelijk te zijn voor de recurrente deletie in de 15q13.3 locus. Antonacci et al. suggereerden de genfamilie GOLGA8 als mogelijke kandidaten. Er werd een poging ondernomen om deze theorieën te valideren met behulp van FISH. Sonde 4 markeert CHRNA7, sonde 5 markeert FAM7A, sonde 2 markeert CHRFAM7A, en sonde 3 markeert een regio distaal van CHRFAM7A (fig. 1). Bij onze patiënten is FAM7A aantoonbaar in beide chromosomen 15. Deze bevinding geeft aan dat het distale breekpunt zich bevindt tussen CHRNA7 en FAM7A. De analyse van patiënten 7 en 4 laat zien dat het proximale breekpunt distaal van CHRFAM7A is gelegen (figs. 3, 4). Bij patiënt 7 overbrugt probe 3 het breekpunt. CHRNA7 en CHRFAM7A mediëren dus niet de recurrente deletie bij onze patiënten.

Evaluatie van in eerdere studies beschreven symptomatische patiënten

Voor patiënten en studies, zie tabel 2 en online aanvullend materiaal 1 (voor alle online aanvullend materiaal, zie www.karger.com/doi/10.1159/000443343). Statistische analyse werd uitgevoerd door Fisher’s exact test, met behulp van software ‘R’. Resultaten met p < 0,05 werden als significant beoordeeld.

Discussie

De familie die wij presenteren vertoont interessante kenmerken. Enerzijds varieert de graad van verwantschap, anderzijds verschillen ook de symptomen (fig. 2). Er is echter geen aanwijsbaar verband tussen de graad van verwantschap en de symptomen. Patiënten 2 en 3, die zusters zijn, zijn opmerkelijk verschillend. Zij verschillen aanzienlijk in lichaamsafmetingen, karakter en ernst van de symptomen, hoewel zij aan soortgelijke omgevingsfactoren zijn blootgesteld en dezelfde deletiegrootte dragen. Andere genetische factoren zullen dus zeker van invloed zijn op de mate van klinische manifestaties. Een mogelijke verklaring zou een veranderde expressie van haar genen in het genoom kunnen zijn, die uiteenlopende effecten kan hebben . Deze benadering is verder bevestigd door Henrichsen e.a. , die hebben aangetoond dat CNV-regio’s tot expressie komen op lagere en meer variabele niveaus en de expressie van naburige genen wijzigen. Chaignat et al. verklaarden dat CNV’s de expressietiming van genen tijdens de ontwikkeling bij muizen veranderen. Bovendien kunnen bij verschillende individuen verschillende temporele expressiepatronen worden aangetroffen. Bovendien kunnen veranderde expressie of mutaties van verschillende genen die coderen voor verschillende stappen van dezelfde neurobiologische pathway, de neurologische symptomen versterken. Poot et al. suggereren verschillende mechanismen die kunnen leiden tot fenotypische pleiotropie van CNVs, bijvoorbeeld de interactie van CNVs, genetische epistase of allelische uitsluiting.

Drie van de 4 familieleden vertonen ADHD; allen vertonen ontwikkelingsachterstand. Aangezien de oorsprong van ADHD blijkbaar multifactorieel is, is het niet verwonderlijk om een opeenstapeling in één familie te vinden. Opmerkelijk is dat alle kinderen getroffen zijn door de deletie. Bepaalde familiale genetische constellaties verhogen mogelijk de kans op manifestatie van symptomen. Bovendien kan de intra-uteriene omgeving van de deletie-dragende moeder het fenotype van haar kinderen hebben beïnvloed. Er konden echter geen gedeelde CNVs worden geïdentificeerd die correleerden met het optreden van symptomen, en er kon geen tweede pathogene CNV worden geïdentificeerd in een van onze patiënten.

De breekpuntanalyse toont aan dat het distale breekpunt distaal is gepositioneerd ten opzichte van CHRNA7. Mogelijke locaties zouden zijn binnen de genfamilies FAM7A of GOLGA8, zoals reeds is gesuggereerd, of binnen de controlegebieden van de locus. Het proximale breekpunt ligt distaal van CHRFAM7A. Bij patiënten 1-4, die tot één familie behoren, verschillen de deletiegroottes die door de aCGH-analysesoftware zijn gedetecteerd. Deze verschillen worden veroorzaakt door hiaten in het distributiepatroon van oligonucleotiden in de aCGH binnen en rond de breekpuntregio’s. Geringe veranderingen in de logverhouding van marginaal gelokaliseerde oligonucleotiden resulteren in een aanzienlijke verschuiving van de door de analysesoftware gedetecteerde deletiegrootte. Het duidelijke verschil in grootte van de recurrente deletie 15q13.3 is hoogstwaarschijnlijk een artefact van de verwerkingssoftware. We gaan ervan uit dat de deletie identiek is voor alle familieleden (zie online suppl. materiaal 2).

Verschillende CNV studies hebben een associatie aangetoond van de 15q13.3 microdeletie met schizofrenie, epilepsie en autisme. Er zijn verschillende publicaties verschenen waarin nieuwe gevallen en theorieën worden gepresenteerd over breekpunten en factoren die de symptomen veranderen. Getracht werd deze informatie samen te voegen om nieuwe verbanden te vinden.

De resultaten laten ruimte voor speculaties. Deleties worden in 80,88% overgeërfd. Maternale fatsoenlijkheid wordt onevenredig vaker beschreven voor deleties (54,41%, p = 0,001) en duplicaties (53,33%, p = 0,027).

Een verklaring zou kunnen worden gegeven door Sinkus et al. .Zij bestudeerden de impact van CHRNA7 promotor polymorfismen, die het niveau van transcriptie met ∼25% verlagen en het cortisolniveau in moeder en kind beïnvloeden. De cortisolspiegel van het kind wordt verder verlaagd, als zowel de moeder als het kind polymorfismedragers zijn. De invloed van de intra-uteriene omgeving kan ook van invloed zijn op andere factoren. De OFC is verlaagd bij patiënten als de deletie door de moeder wordt geërfd (P<25 in 50%, p = 0,002). Daarom nemen wij aan dat als de afwijking door de moeder wordt overgeërfd, de intra-uteriene omgeving de symptomen zal versterken. Aangezien we alleen symptomatische patiënten in deze beoordeling hebben opgenomen, zou dit verklaren waarom de meerderheid van de afwijkingen blijkbaar van maternale oorsprong is (54%, p = 0,001). In dit verband is het opvallend dat de verdeling van de deletie over de geslachten gelijk is. Onze gegevens bevestigen de bevindingen van Lowther et al. In hun uitgebreide review van de 15q13.3 deletie, combineerden zij symptomatische en asymptomatische patiënten. Aangezien wij alleen symptomatische patiënten hebben opgenomen, zijn de verhoudingen van de distributiepatronen van de kenmerken vergelijkbaar, maar de relatieve aantallen verschillen. Met betrekking tot de verhoogde maternale deftigheid van deleties, stellen zij een verminderde reproductieve fitheid bij mannen als mogelijke verklaring.

De grootte van de deletie correleert niet consistent met de mate van symptomen. Bijvoorbeeld, het vergelijken van de mate van intellectuele tekortkomingen met de grootte van de deletie toont geen lineair verband. Patiënten met de typische 1.6-Mb deletie vertonen vaker ernstige tekorten dan patiënten met kleinere of grotere deleties (41.07%, p = 0.00045). Intellectuele tekorten worden significant vaker gerapporteerd bij patiënten met deleties dan duplicaties (79,78 en 55,56%, p = 0,037). Zoals verwacht wordt normale intelligentie het vaakst beschreven bij patiënten met deleties <1 Mb (45%, p = 0,0037).

Deleties met een grootte van 1-1,6 Mb komen het vaakst voor (63,21%, p = 0,0002). Duplicaties <1 Mb (66,67%, p = 0,0004) worden het vaakst beschreven. Wat deleties betreft, worden intellectuele tekorten (79,78%), taalstoornis (75,34%), een opvallend fenotype van de ouders (66,67%), en gedragsproblemen (63,64%) veel vaker beschreven dan epilepsie (30,61%) of autisme (27,71%) (p = 0,02-3,931E-09). Als duplicaties en deleties worden vergeleken, zijn duplicaties vaker geassocieerd met autisme (p = 0,039) en het fenotype van de ouders komt opvallend minder vaak voor (p = 0,027).

Epilepsie is significant geassocieerd met milde intellectuele tekortkomingen (59,09%, p = 0,0029). Taalstoornis is geassocieerd met intellectuele tekortkomingen in 79,24% van de gevallen (p = 0,003).

Tot besluit kan worden gezegd dat het klinische fenotype van de microdeletie 15q13.3 van multifactoriële oorsprong is. Zelfs naaste familieleden die blootgesteld zijn aan vergelijkbare omgevingsfactoren verschillen aanzienlijk in hun klinische manifestaties. Genetische counseling in families met 15q13.3 microdeleties of met name microduplicaties blijft dus complex en soms inadequaat. Verder onderzoek naar genetische veranderingen met betrekking tot het niet-verwijderde allel of promotor regio’s van getroffen genen kan veelbelovender zijn als het gaat om het ontdekken van beïnvloedende factoren.

Acknowledgments

De auteurs danken Margot Fliegauf, Monika Heinkelein, Helga Heitzler, en Claudia Ladwig in de cytogenetische groep van het Instituut voor Menselijke Genetica in Freiburg voor hun experimenteel advies en assistentie. Wij danken ook Ekkehart Lausch, Elke Botzenhart, Susanne Munk-Schulenburg, en Andreas Busche voor de patiëntenzorg. We zijn de patiënten en hun families dankbaar voor hun vriendelijke medewerking.

Statement of Ethics

De auteurs hebben geen ethische conflicten te melden.

Disclosure Statement

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.