Clonogenic assay: what, why and how

Een clonogenic assay, ook wel colony formation assay genoemd

is een in vitro celsurvivalentie-test. De test beoordeelt het vermogen van afzonderlijke cellen om te overleven en zich te reproduceren tot kolonies.1 Deze test werd voor het eerst beschreven in de jaren 1950, waar hij werd gebruikt om de effecten van straling op de overleving en groei van kankercellen te bestuderen en heeft daarna een essentiële rol gespeeld in de radiobiologie.2

Om de clonogeniciteit te meten, moeten cellen bij een zeer lage dichtheid worden uitgezaaid en moet men ze 1-3 weken laten staan om kolonies te vormen. De kolonies worden vervolgens gefixeerd, gekleurd met kristalviolet om ze zichtbaar te maken, en geteld. Om de gegevens te analyseren worden celoverlevingscurven uitgezet. Vandaag de dag worden clonogene testen gebruikt om een verscheidenheid aan experimentele vragen te beantwoorden, met name in de kanker biologie.

Deze blog belicht:

Hoe een klonogene assay uit te voeren met belangrijke overwegingen om onderweg te maken

Het gebruik van labelvrije microscopie en confluentiedetectie om het aantal kolonies en de grootte te beoordelen met behulp van geautomatiseerde beeldkwantificatie

De klonogene overlevingsassay

Clonogene assays worden veel gebruikt op het gebied van kankeronderzoek, omdat de vorming van klonen wordt geïnterpreteerd als een eigenschap van kankercellen met tumor initiërende capaciteiten. Hoewel deze assay aanvankelijk werd gebruikt op het gebied van de radiobiologie, is het een standaardinstrument geworden in het kankeronderzoek om de celgroei en de cytotoxische of genotoxische effecten van verschillende agentia met potentiële klinische toepassing te evalueren. Dit omvat chemotherapeutische middelen en gerichte therapieën op zichzelf of in combinatie 3.

Clonogene groei wordt ook gebruikt voor de evaluatie van de stambaarheid van bepaalde celpopulaties, aangezien stamcellen langlevende cellen zijn met het vermogen tot voortdurende proliferatie. Dit is bijzonder relevant voor kankeronderzoek omdat kankerstamcellen vaak geassocieerd worden met chemoresistentie, de vorming van secundaire tumoren, en kankerrecidief. Daarom is het onderzoeken van kankerstamcellen met behulp van een clonogene assay een waardevol en veel gebruikt instrument om de werkzaamheid van een bepaalde therapie te voorspellen.4

Clonogene assays meten het vermogen van cellen om hun voortplantingsintegriteit gedurende een langere periode te behouden. Dit is een belangrijke eigenschap omdat hierdoor fenotypische effecten aan het licht komen die tijd en mogelijk verscheidene celdelingen vergen om zich te ontwikkelen. Dit is bijzonder belangrijk bij de analyse van therapeutische resistentie. Resistentie tegen geneesmiddelen kan niet worden vastgesteld met kortetermijncytotoxiciteitstests.5

Hoe een clonogene assay uit te voeren

De informatie in dit deel is aangepast aan Franken et al. (2006) die een protocol voor clonogene assays in Nature Protocols1 hebben gepubliceerd, gecombineerd met enkele inzichten uit mijn eigen ervaring die ik heb opgedaan met het uitvoeren van meer dan 60 clonogene assays tijdens mijn promotieonderzoek.

In wezen zijn er twee verschillende manieren om een clonogene assay uit te voeren:

(1) Cellen kunnen bij lage dichtheden worden gezaaid en vervolgens worden behandeld om het effect van de behandeling op de clonogeniciteit van cellen te onderzoeken.

(2) Cellen kunnen gedurende een bepaalde periode worden behandeld en vervolgens opnieuw worden gekweekt bij lage dichtheden in behandelingsvrije media om het klonogeen vermogen te testen.

Dit laatste wordt vaak gebruikt om de therapeutische resistentie na behandeling te beoordelen. Figuur 1 geeft een overzicht van de eerste benadering, die de traditionele methode is om een clonogene test uit te voeren. Zoals duidelijk zal worden, is dit een tijdrovende methode die geen informatie over het verloop van het experiment oplevert (alleen eindpunt). Wij zullen geautomatiseerde en niet-eindpunt alternatieve methoden later bespreken.

Traditioneel protocol voor klonogene assays

Figuur. 1 | Een samenvatting van een traditioneel clonogeen protocol waarbij cellen worden gezaaid, behandeld en vervolgens de clonogeniciteit wordt beoordeeld.

Clonogenic assays worden meestal uitgevoerd in 6-well of 24-well platen. Cellen moeten spaarzaam en gelijkmatig worden uitgezet zodat zich geïsoleerde kolonies kunnen vormen. Daarom is het belangrijk om uw zaaidichtheid te optimaliseren voor de door u gekozen putgrootte voordat u uw clonogene assay uitvoert.

Een goed uitgangspunt is om te kijken in de literatuur om te zien of er studies hebben uitgevoerd klonogene assays met uw cellijn en dan test deze zaaien dichtheid en twee of drie anderen. Tijdens dit optimalisatieproces is het ook belangrijk om rekening te houden met uw experimentele eindpunt (bv. 7 dagen, 14 dagen of 21 dagen) en celgroeisnelheid, omdat u geen samensmelting van kolonies wilt, die zal interfereren met kolonie kwantificering en analyse. Zaaddichtheden moeten hetzelfde zijn voor alle behandelingscondities binnen uw experiment.
Het gebruik van de juiste controles is van cruciaal belang voor de analyse fase. Er moet altijd een onbehandelde controle worden gebruikt, evenals een controle met alleen een medium (dit kan DMSO, PBS of een oplosmiddel zijn waarin uw behandeling is opgelost). Voor de behandelingscondities wordt vaak een verdunningsreeks gebruikt. De behandelingsduur en de intensiteit van de behandeling zullen mede bepalend zijn voor het concentratiebereik – dit zal waarschijnlijk enige optimalisering vergen. Elke controle- en experimentele conditie moet in drievoud worden uitgevoerd.

Tijdens de kolonievormingsfase moet de koloniegroei onder alle behandelingscondities worden gecontroleerd. Een kolonie wordt geacht 50 cellen of meer te omvatten en is alleen zichtbaar onder een microscoop. Aangezien deze test typisch over een lange periode wordt uitgevoerd, moet u uw celmedia verversen. De cellen zullen in het begin een zeer lage confluentie hebben, zodat u de media niet zo regelmatig als normaal hoeft te verversen. Als u echter cellen zaait en vervolgens behandelt met een geneesmiddel of verbinding, is het belangrijk rekening te houden met de halfwaardetijd en indien nodig een nieuwe behandeling toe te voegen.

Voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het imaging van de kolonie groei in de tijd. Wij raden aan te kijken naar de CytoSMART Omni.

—————–

Het zijn vaak de kolonies onder de controlevoorwaarden die het snelst groeien en daarom kunt u deze cellen gebruiken als een indicatie van uw experimentele eindpunt, d.w.z. beëindig het experiment voordat uw kolonies beginnen samen te smelten en als dit te snel gebeurt, gebruik dan liever een lagere zaaidichtheid voor uw experiment. Het is belangrijk om het experiment voor alle behandelingscondities op hetzelfde moment te beëindigen.

Zodra u uw experimentele-eindpunt bereikt, cellen moeten voorzichtig worden gewassen met PBS (voeg de PBS aan de zijkant van de put om niet te verstoren de kolonies), gefixeerd, en gekleurd met het DNA intercalerende kleurstof, kristalviolet (0,5% w / v) gedurende ten minste 30 minuten. Het verwijderen van de overtollige kleurstof kan een smeerboel zijn. De beste techniek is de platen voorzichtig in waterbekers onder te dompelen totdat alle overtollige kleurstof is verwijderd en u alleen nog helderpaarse kolonies over hebt. De gekleurde kolonies kunnen tot 50 weken na de kleuring worden geteld. Maak hoge resolutie foto’s van uw wells om te gebruiken voor analyse, presentaties en publicatie figuren.

Om onderzoekers te ondersteunen bij analyse en optimalisatie van hun kolonievorming assays, heeft CytoSMART een applicatie geïntroduceerd voor de CytoSMART Omni om kolonies te detecteren in (time-lapse) beelden van volledige wells platen bij 10X vergroting. In incubator time-lapse beeldvorming kan kinetische informatie worden verkregen in plaats van end-point, wat meer gedetailleerde informatie kan opleveren over wanneer de behandeling de cellen begint te beïnvloeden. Labelvrije beeldanalyse wordt gebruikt om kolonies te detecteren, hun grootte en circulariteit te evalueren. Pin-point wanneer kolonies beginnen te fuseren en dienovereenkomstig te optimaliseren.

Hoe u uw clonogene assay

Het is echt zo simpel als het handmatig tellen van uw kolonies voor elke behandelingsconditie en het weergeven van de gegevens als een overlevingscurve (u moet ten minste drie biologische herhalingen gebruiken voor uw curve).

Een overlevingscurve vereist dat de overlevende fractie (SF) van behandelde cellen (dit omvat een verhouding van gevormde kolonies tot cellen gezaaid) worden berekend en uitgezet tegen de behandelingsdosis. Voordat u de SF kunt berekenen, moet de uitplatingsefficiëntie (PE) van uw cellen worden bepaald, aangezien verschillende cellijnen verschillende uitplatingsefficiënties hebben en dit van invloed is op de berekening van de overlevingsfractie.

PE is de verhouding tussen het aantal kolonies en het aantal cellen dat in uw onbehandelde cellen is uitgezet1. Figuur 1 toont de PE en SF formules en een voorbeeld van een overlevingscurve.

De handmatige telling van kolonies is vermoeiend en kan gevoelig zijn voor bias, dus een aantal vrij beschikbare geautomatiseerde beeldanalyse tools zijn ontwikkeld voor het analyseren van clonogene assay beelden snel en objectief. Een waardige vermelding is de vrij beschikbare softwarepakket ontwikkeld door Brzozowska et al. (2019) dat niet alleen telt kolonies, maar ook plot hun grootte distributies die een andere laag van nuttige cellulaire gedragsinformatie (zie figuur 2a).6

Een alternatief voor het tellen en kwantificeren van individuele kolonies, is het bepalen van het percentage van de put gebied dat wordt gedekt door kolonies (kolonie gebied percentage) om de clonogene celgroei te kwantificeren. Guzmán et al. (2014) ontwikkelden een vrij beschikbare ImageJ-plugin genaamd ColonyArea die precies dit doet (zie figuur 2b).7Dit is een nuttig hulpmiddel om te gebruiken als u samengevoegde kolonies hebt die moeilijk te tellen zijn met het oog of door kolonietelsoftware of als u een snelle en high throughput analysemethode wilt.

Figuur. 2 | Vrij verkrijgbare meetinstrumenten voor clonogene assays. (A) Brzozowska et al. ontwikkelde software (countPHICS) die kolonies telt en koloniegrootte meet.6 (B) Guzmán et al. ontwikkelde een ImageJ plugin, ColonyArea, die koloniegroei gebied en kleuring intensiteit kwantificeert.7

Labelvrije, niet-endpoint, semi-geautomatiseerde clonogene assayprotocol

Een recent paper van Mayr et al. (2018), beschrijft een nieuw en gewijzigd clonogene assayprotocol dat een 96-well microplate-formaat en confluentiedetectie gebruikt om kolonies te meten. Deze methode maakt uitgebreide experimentele opstellingen mogelijk met behulp van een 96-well-plaat, het is labelvrij, heeft geen kleuring eindpunt, en de analyse is semi-automatisch (figuur 3)8. Bovendien, tijd-resolved, non-endpoint confluentie meting van dezelfde put bleek dat semi-automatische analyse geschikt was voor het bepalen van kolonie aantal en de gemiddelde grootte.

Figure. 3 | Mayr et al. evalueerden de clonogene groei in het 96-wells formaat in de tijd met behulp van confluentiedetectie8. De grafiek toont de kwantificering van de clonogene groei op verschillende tijdstippen en de afbeeldingen tonen specifieke wells met confluentiedetectie. Groene vlekken vertegenwoordigen gebieden die door een confluentielezer zijn gedetecteerd en oranje pijlen geven samengevoegde kolonies aan.

Deze clonogene testmethode biedt een tijd- en kosteneffectief alternatief voor het standaard clonogene testprotocol. Zonder eindpunt fixatie en kleuring vereist, dit protocol maakt continue monitoring en analyse van clonogene groei. Bovendien kunnen extra metriek over de kinetiek van koloniegroei ook worden geëxtraheerd tijdens het experiment. De geminiaturiseerde formaat opent ook de mogelijkheid om dure behandelingen, zoals siRNA-gebaseerde of CRISPR / Cas9-gebaseerde therapieën die niet haalbaar zou zijn met het volume van de behandeling die nodig is voor een 6-well of 24-well plaat te testen. Uiteindelijk toonden Mayr et al. aan dat labelvrije microscopie met confluentiedetectie een robuuste en levensvatbare optie is voor het meten van clonogeniciteit.

Een labelvrije, niet-eindpunt en geautomatiseerde oplossing voor uw clonogene assays is de CytoSMART Omniw met zijn kolonie detectie algoritme. Kolonievorming wordt gemeten in de tijd over een volledige well met kolonietelling, grootte en circulariteitsuitlezing. Uw cellen hoeven de incubator niet te verlaten en cellulaire kinetische informatie tijdens het proces van kolonievorming kan worden verkregen (figuur. 4).

Figuur 4 | Geautomatiseerde koloniedetectie met behulp van de CytoSMART Omni. HEP-G2 leverkankercellen in een 24-well-plaat werden gedurende 75 uur afgebeeld met de CytoSMART Omni, die in een standaard CO2-incubator wordt gehouden. De afbeelding toont een volle well nadat het koloniedetectiealgoritme werd uitgevoerd met clusters van cellen die worden gemarkeerd door het oranje koloniemasker. Het aantal kolonies, de grootte en de circulariteit werden gemeten tijdens de duur van de test en in de grafieken weergegeven.

Lees hier meer over alle CytoSMART beeldvormingsoplossingen