Effect van oraal toegediend Atractylodes macrocephala Koidz waterextract op de ontstekingsreactie van macrofagen en T-cellen bij muizen

Abstract

De wortelstok van Atractylodes macrocephala Koidz (AM) is een bestanddeel van verschillende recepten voor Qi-versterkende samenstellingen. We evalueerden de ontstekingsreacties in macrofagen en T-cellen geïsoleerd uit muizen na orale toediening van AM water extract (AME). Peritoneale exsudaatcellen werden geïsoleerd uit muizen die geïnjecteerd waren met thioglycollaat en veranderingen in scavenger receptoren werden onderzocht. Peritoneale macrofagen werden gestimuleerd met lipopolysaccharide (LPS). Serum cytokine reacties op intraperitoneale LPS injectie werden ook geëvalueerd. Splenocyten werden geïsoleerd en hun samenstelling en functionele respons werd gemeten. Het gehalte aan atractylenolide I en atractylenolide III, bekende ontstekingsremmende bestanddelen, in AME was respectievelijk 0,0338 mg/g extract en 0,565 mg/g extract. AME verhoogde het aantal SRA(+)CD11b(+) cellen in reactie op thioglycollaat. Peritoneale macrofagen geïsoleerd uit de AME groep vertoonden geen veranderingen in ontstekingsmarkers zoals tumor necrose factor- (TNF-) α, interleukine- (IL-) 6, induceerbaar stikstofmonoxide synthase, en cyclooxygenase-2 maar vertoonden een afname in CD86 expressie. Interessant is dat AME de serumniveaus van TNF-α en IL-6 verlaagde na intraperitoneale injectie van LPS. Wat het adaptieve immuunsysteem betreft, verhoogde AME de CD4(+) T-celpopulatie en de expressie van het major histocompatibility complex klasse II molecuul in de milt, en gekweekte splenocyten van de AME-groep vertoonden een verhoogde productie van IL-4 samen met een verlaagde productie van interferon-γ tijdens T-celactivatie. AME bevorderde de aanvulling van peritoneale macrofagen tijdens de ontstekingsreactie, maar de ontstekingsremmende activiteit leek niet gemedieerd te worden door de modulatie van macrofaagactiviteit. AME veranderde ook de immuunstatus van CD4 T cellen, en bevorderde de Th2 respons.

1. Inleiding

Inflammatie is een beschermende reactie om schadelijke stimuli te elimineren, en immuuncellen zijn de belangrijkste deelnemers aan dit proces. Afhankelijk van de modaliteit van de antigeenherkenning en de capaciteit om een geheugenrespons te genereren, worden immuuncellen onderverdeeld in het aangeboren immuunsysteem en het adaptieve immuunsysteem. Aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen en dendritische cellen, reageren onmiddellijk op antigeen met een beperkte receptorspecificiteit. Adaptieve immuuncellen, bestaande uit T-cellen en B-cellen, zijn antigeenspecifiek, beginnen een reactie op antigeen dat het perifere lymfoïde weefsel is binnengedrongen, en genereren een geheugenrespons . De aangeboren immuuncellen spelen de hoofdrol in de vroege stadia van ontsteking, maar na verloop van tijd nemen de adaptieve immuuncellen het over.

De in het weefsel verblijvende macrofagen spelen een sleutelrol in de immuniteit en de integriteit van het weefsel . De meeste weefselmacrofagen zijn afkomstig van embryonale voorlopers. Onder steady-state omstandigheden worden hun populaties in stand gehouden door hun lange levensduur en door lokale proliferatie, en sommige macrofagen worden aangevuld door van bloedmonocyten afgeleide cellen . Tijdens een ontsteking worden uit het beenmerg afkomstige monocyten naar de plaats van de ontsteking gerekruteerd en differentiëren zij in macrofagen. Macrofagen elimineren pathogenen en antigenen door fagocytose en induceren ontstekingsreacties door de productie van cytokinen en enzymen zoals tumor necrose factor- (TNF-) α, interleukine- (IL-) 6, induceerbaar stikstofoxide synthase (iNOS), en cyclooxygenase- (COX-) 2. Bovendien zijn macrofagen een type professionele antigeenpresenterende cellen (APC’s) die antigenen aan T-cellen presenteren.

T-cellen, die hoofdzakelijk bestaan uit CD4 T-cellen en CD8 T-cellen, worden geactiveerd wanneer T-celreceptoren (TCR’s) in contact komen met antigene peptiden die gebonden zijn aan major histocompatibility complex (MHC)-moleculen op APC’s. CD4 T-cellen, die meer dan tweederde van de T-cellen uitmaken, kunnen worden gedifferentieerd in verschillende effector T-helpercellen (Th-cellen), zoals Th1, Th2, Th17, T-follliculaire helpercellen en T-regulatorcellen. Van deze subsets waren Th1- en Th2-cellen de eerste types die werden gedefinieerd. Th1 cellen scheiden hoge niveaus van interferon- (IFN-) γ af en zijn efficiënt in de verdediging tegen intracellulaire pathogenen door macrofagen te activeren, terwijl Th2 cellen interleukine- (IL-) 4, IL-5, en IL-13 afscheiden en de gastheer beschermen tegen helminth infectie door eosinofielen en mestcellen te rekruteren. Hoewel deze T-helpercellen belangrijk zijn voor de verdediging van de gastheer, kan chronische activatie van elk Th-celtype immuungemedieerde aandoeningen veroorzaken. Th1 cellen spelen een cruciale rol in orgaan-specifieke autoimmuniteit en chronische ontstekingsziekten en Th2 cellen zijn verantwoordelijk voor allergische ontstekingen.

De wortelstok van Atractylodes macrocephala Koidz (AM), behorend tot de Compositae, is gebruikt voor de behandeling van functionele defecten in het spijsverteringsstelsel, zoals verlies van eetlust, abdominale distentie, en diarree. Volgens de traditionele Chinese geneeskunde versterkt AM de Qi door abnormale vochtretentie in het maag-darmkanaal op te lossen. AM is een bestanddeel van verschillende recepten voor Qi-versterkende samenstellingen. In de traditionele Chinese geneeskunde is een van de essentiële functies van Qi verdediging. Daarom wordt gedacht dat Qi versterkende kruiden het immuunsysteem versterken. Aangezien Qi-versterkende kruiden preventief worden ingenomen om de immuunstatus van personen zonder openlijke gebreken te verbeteren, is het noodzakelijk te evalueren hoe het immuunsysteem bij normale personen kan worden gewijzigd na toediening van AM. Ondanks het frequente gebruik ervan, zijn er weinig studies geweest om de effecten van AM op het immuunsysteem te onderzoeken.

AM bevat verschillende bioactieve sesquiterpenoïden zoals atractylenolide I, atractylenolide II, en atractylenolide III en polyacetylenes . In vitro behandeling van macrofagen met atractylenolide I, atractylenolide III, en sommige polyacetylenische verbindingen remde lipopolysaccharide- (LPS-) geïnduceerde TNF-α en iNOS expressie . Orale toediening van deze vetoplosbare componenten vertoonde ontstekingsremmende activiteit bij muizen. De meeste traditionele kruidenpreparaten zijn echter afkooksels op waterbasis, wat resulteert in een lage opbrengst aan farmacologisch actieve vetoplosbare componenten. Bovendien kunnen polyacetylenen gemakkelijk worden vernietigd in kokend water. Daarom wilden wij nagaan of ontstekingsremmende reacties optreden in macrofagen geïsoleerd uit muizen die AM geëxtraheerd kregen in kokend water (AME). We onderzochten ook het effect van AME op de serum ontstekingsreactie. Tenslotte onderzochten we de samenstelling en functionele respons van splenocyten op een eventuele verandering in het adaptieve immuunsysteem na AME suppletie.

2. Materialen en Methoden

2.1. Bereiding van het monster

AM afkomstig van Eusung (Zuid-Korea) werd gekocht bij E-Pulip Co., Ltd. (Lot. EPL1356-4) (Seoul, Zuid-Korea). Een voucher specimen (# 2013-AM) werd gedeponeerd in het Laboratorium voor kruidenimmunologie, Kyung Hee University. Kort samengevat werd 100 g van het monster vermalen, geëxtraheerd met 1 L gedeïoniseerd water (DW) in een refluxapparaat en verwarmingsmantel gedurende 2 uur bij 95 °C, en gefiltreerd door Whatman nummer 2-filterpapier (Whatman International, Kent, Engeland). Het extract werd geconcentreerd met een rotatieverdamper en gevriesdroogd onder vacuüm. De opbrengst van AME was 37,7%. Voor analyse met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) werd 0,4 g AME opgelost in 10 ml DW en gedurende 5 minuten bij 25°C met een sonicator gekoeld. Het extract werd toegevoegd aan ethylacetaat, geschud om te mengen, en 1 min. laten staan. De bovenste laag ethylacetaat werd overgebracht en deze procedure werd driemaal herhaald. De laatste ethylacetaatlaag werd geconcentreerd en gevriesdroogd.

2.2. HPLC

De monsters werden geanalyseerd met een omgekeerde-fase HPLC-systeem (Shimadzu 20A, Kyoto, Japan) dat bestond uit een autosampler (SIL-20A), een binaire pomp (LC-20AD), en een fotodiode-arraydetector (SPD-20A) en was uitgerust met een YMC-Triart C18-kolom (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Japan). De gradiëntstromen voor het systeem met twee oplosmiddelen (oplosmiddel A, 0,05% fosforzuur in water; oplosmiddel B, acetonitril) waren als volgt: 85% A/15% B bij 0 min, 85% A/15% B bij 5 min, 50% A/50% B bij 15 min, 50% A/50% B bij 20 min, 40% A/60% B bij 25 min, 40% A/60% B bij 30 min, 15% A/85% bij 35 min, 15% A/85% bij 40 min, 85% A/15% bij 42 min, en 85% A/15% bij 45 min. De stroomsnelheid van de mobiele fase was 1,0 ml/min met een injectievolume van 10 μl. Detectie vond plaats bij 220 nm voor atractylenolide III (Sigma, St. Louis, MO, USA) of bij 280 nm voor atractylenolide I (Sigma).

2.3. Dieren

Zeven weken oude mannelijke Balb/c muizen werden verkregen van SamTaco (Osan, Zuid-Korea) en gehuisvest in een temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde pathogeenvrije dierfaciliteit met een 12-h licht-donkercyclus. Alle dieren ondergingen 1 week aanpassing voorafgaand aan de experimenten. De doses werden bepaald aan de hand van een berekening die was geëxtrapoleerd uit het verschil in lichaamsoppervlak tussen een muis en een mens. De aanbevolen dosis AM voor een volwassen mens van 60 kg is 8-24 g ruwe plant per dag of 3-9 g extract per dag (gebaseerd op het extractierendement in deze studie). De dosis voor muizen kan als volgt worden bepaald: een humaan equivalente dosis van 50-150 mg/kg × 12,3 (de omzettingscoëfficiënt) = een dosis voor muizen van 615-1.845 mg/kg. Op basis van dit dosisbereik hebben wij voor deze studie doses van 500 mg/kg en 2.500 mg/kg gekozen. Dieren werden willekeurig toegewezen aan experimentele groepen. AME werd eenmaal daags toegediend via een orale maagsonde gedurende 10 dagen. Er waren geen verschillen in lichaamsgewicht tussen de groepen tijdens de experimentele periode. Het dierprotocol werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-012), en de muizen werden verzorgd volgens de US National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals (1996) specificaties.

2.4. Macrofaagvoorbereiding

Voor macrofaagisolatie werden muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met 2 ml van 3,5% steriel thioglycollaat (BD, Sparks, MD, VS) 4 dagen voor het offer. Aan het einde van het experiment werden de muizen opgeofferd door cervicale dislocatie en de peritoneale exsudaatcellen werden aseptisch geïsoleerd door peritoneale lavage met koud DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) dat 10% foetaal runderserum (FBS; Hyclone) en 1% penicilline-streptomycine bevatte. Na centrifugatie werden de cellen geresuspendeerd en geteld met behulp van een TC20 celteller (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.5. Voorbereiding van de milt

Voor de isolatie van de milt werden de milten aseptisch verkregen aan het einde van het experiment. Na disruptie van de milt tussen glasplaatjes in RPMI 1640 (Hyclone) met 1% FBS en 1% penicilline-streptomycine, werden de cellen gefiltreerd door een 70-µm celzeef. Na centrifugatie werden de rode bloedcellen gelyseerd met BD PharmLyse lysingbuffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). De cellen werden geresuspendeerd in RPMI 1640 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en geteld met een T20 celteller. Intraperitoneale Injectie van LPS

Muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 1,3 mg/kg LPS (serotype 055:B5, Sigma) aan het einde van het experiment. Na 1 uur werden de muizen verdoofd met ether en werd bloed afgenomen door middel van een hartpunctie. Serum werd verkregen en bewaard bij -20°C tot analyse.

2.7. Cell Culture

Peritoneale exsudaat cellen werden uitgezet in 6-well platen of 60-mm schalen en ’s nachts geïncubeerd bij 37 ° C. Na verwijdering van de niet-adherente cellen werden de aangehechte cellen gedurende 24 uur gestimuleerd met 100 ng/ml LPS. Het supernatant en de cellen werden verzameld voor latere bepalingen. Splenocyten werden uitgezet in 24-well platen en gestimuleerd met 2 μg/ml anti-CD3 antilichaam (BD Biosciences) gedurende 48 h. Supernatant werd verzameld voor cytokine analyse.

2.8. Flow Cytometry

Cellen werden tweemaal gewassen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en geresuspendeerd bij 1 × 106 cellen/ml in FACS-buffer (PBS/0,1% NaN3/1% FBS). Cellen werden geblokkeerd met rat anti-muis CD16/CD32 antilichaam (BD Biosciences) bij 4 ° C gedurende 5 min en vervolgens gekleurd met fluoresceïne-geconjugeerd anti-muis SR-AI, PE-geconjugeerd anti-muis LOX1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), PE-geconjugeerd anti-muis CD36, FITC-geconjugeerd CD11b, PE-geconjugeerd anti-CD11b, PE-geconjugeerd anti-muis CD86, FITC-geconjugeerd anti-muis CD4, PE-geconjugeerd anti-muis CD8a, FITC-geconjugeerd anti-muis CD19, en FITC-geconjugeerd anti-muis IA/IE (BD Biosciences) (alle antilichamen waren verdund 1:100) gedurende 30 minuten op ijs in het donker. Bijpassende isotype antilichamen werden gebruikt om niet-specifieke binding aan te tonen. De cellen werden gewassen en geresuspendeerd in FACS-buffer. In totaal werden 10.000 events verkregen op een Navios flowcytometer (Beckman Coulter, La Brea, CA, USA), en de gegevens werden verwerkt met Kaluza-software (Beckman Coulter).

2.9. Cytokine Analysis

De niveaus van TNF-α, IL-6, IFN-γ, en IL-4 in supernatanten en sera werden bepaald met behulp van BD OptEIA muis ELISA sets (BD Biosciences) volgens het protocol van de fabrikant.

2.10. Proliferatie Assay

Splenocyten (4 × 105) in 96-well platen werden gestimuleerd met oplosbare anti-CD3 mAb (2 ug / ml) gedurende 48 h. Celproliferatie werd bepaald met behulp van de CellTiter96 One Solution Cell Proliferation assay kit (Promega, Madison, WI, USA).

2.11. RNA Isolatie en Real-Time PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van een FavorPrep Total RNA Purification Kit (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan), en cDNA werd omgekeerd getranscribeerd met behulp van een High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Verdund cDNA werd gemengd met Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) en 2 pmol van de primers specifiek voor iNOS, COX2, of GAPDH. Amplificatie van cDNA werd uitgevoerd met behulp van een StepOnePlus real-time PCR-systeem (Applied Biosystems). Na initiële thermische denaturatie bij 95 ° C gedurende 10 min, werden de PCR-condities ingesteld op 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min gedurende 40 cycli. Voor elke PCR werd een overeenkomstig mRNA-monster zonder omgekeerde transcriptie opgenomen als negatieve controle. Kwantificering van het cDNA-kopie-aantal werd bereikt met behulp van een standaardcurve.

2.12. Statistische analyse

De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde standaardfout van het gemiddelde (SEM). Tweezijdige Student’s t-test of tweezijdige variantieanalyse werd toegepast om verschillen tussen groepen te vergelijken. Als uit de statistische analyse bleek dat verschillen tussen meerdere groepen significant waren, werd de Tukey post hoc test gebruikt voor verdere vergelijking. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met IBM SPSS 22.0 versie software (IBM, Chicago, IL, USA). P-waarden minder dan 0,05 werden als significant beschouwd.

3. Resultaten

3.1. Gehalte aan atractylenolide I en atractylenolide III in AME

Van de bekende kwaliteitscontrole-markers zijn atractylenolide I en atractylenolide III in vitro geverifieerde ontstekingsremmende verbindingen. De ethylacetaatfractie van AME werd voorlopig geïdentificeerd met behulp van een input van authentieke standaarden met vergelijking van retentietijden en UV-zichtbaarheidsspectrale patronen. De HPLC-chromatogrammen zijn weergegeven in figuur 1. Het gehalte aan atractylenolide I en atractylenolide III in AME was respectievelijk 0,0338 mg/g extract en 0,565 mg/g extract.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. Effect of Oral Administration of AME on Scavenger Receptor Expression in Mouse Peritoneal Exudate Cells

Intraperitoneale injectie van thioglycollaat wordt vaak gebruikt om steriele peritonitis te induceren en peritoneale macrofagen van muizen in laboratoria te verrijken. De meeste peritoneale macrofagen zijn afkomstig van bloedmonocyten. Wij verzamelden met deze methode peritoneale exsudaatcellen van met AME behandelde muizen. CD11b werd gebruikt als een marker voor macrofagen. Scavenger receptoren zoals SRA, CD36, en LOX-1 worden geüpreguleerd tijdens de differentiatie van monocyt naar macrofaag; daarom onderzochten we de expressie van deze eiwitten. SRA, CD36, en LOX-1 kwamen bijna uitsluitend tot expressie in CD11b(+) cellen (Figuren 2(a)-2(c)). Het percentage SRA(+)CD11b(+)-cellen in de controlegroep was 66%, en behandeling met 500 mg/kg en 2.500 mg/kg AME verhoogde deze populatie aanzienlijk tot 69% en 76%, respectievelijk. De frequenties van CD36(+)CD11b(+) en LOX-1(+)CD11b(+) celpopulaties in de controlegroep waren respectievelijk 95% en 14%, en AME induceerde geen significante veranderingen in beide populaties. De toename van de SRA(+)CD11b(+) celpopulatie geeft aan dat AME de differentiatie van bloedmonocyten tot macrofagen kan stimuleren in reactie op thioglycollaat.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.3. Effect of Oral Administration of AME on Surface CD86 Expression in LPS-Stimulated Macrophages

Costimulerende moleculen zoals CD86 op macrophages zijn nodig om de crosstalk tussen macrophages en Th-cellen te versterken. Peritoneale macrofagen geïsoleerd uit AME-behandelde muizen werden gedurende 24 uur gestimuleerd met LPS en de membraanexpressie van CD86 werd gemeten met behulp van flowcytometrie. Stimulatie met LPS verhoogde de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van CD86 van 5,24 tot 11,24 (figuur 3). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van CD86 in de 500 en 2.500 mg/kg groepen daalde significant tot respectievelijk 10,14 en 10,59. Deze resultaten wijzen erop dat AME de interactie tussen macrofagen en Th-cellen kan beïnvloeden.

(a)

(b)

(a)
(b)

3.4. Effecten van orale toediening van AME op de inflammatoire cytokinerespons in macrofagen en serum

We onderzochten eerst of orale toediening van AME de inflammatoire respons van macrofagen beïnvloedt. Peritoneale macrofagen van de controle- of hooggedoseerde AME-groep werden gedurende 24 uur gestimuleerd met LPS en de productie van TNF-α en IL-6 in het supernatant werd gemeten. Er was geen verschil in het niveau van TNF-α secretie tussen de controle en AME groepen, maar het niveau van IL-6 was verhoogd in de AME groep (figuur 4(a)). We vonden ook dat AME geen veranderingen in iNOS en COX-2 genexpressie in cellen gestimuleerd met LPS induceerde (figuur 4(b)). Vervolgens onderzochten we de systemische respons van met AME behandelde muizen op intraperitoneale LPS-stimulatie. AME verlaagde de serumniveaus van TNF-α en IL-6 met respectievelijk 20% en 47% (figuur 5). Deze bevindingen wijzen erop dat de ontstekingsremmende werking van AME onafhankelijk van de modulatie van macrofagen kan optreden.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figuur 4

Effect van AME op ontstekingsbevorderende cytokinen en enzymen in LPS-gestimuleerde macrofagen. Macrofagen uit de controle- of AME-groep (2500 mg/kg) werden gedurende 24 uur gestimuleerd met LPS (100 ng/ml). (a) De niveaus van tumornecrosefactor- (TNF-) α en interleukine- (IL-) 6 in het supernatant werden bepaald met behulp van ELISA. (b) Kwantitatieve PCR werd gebruikt om de expressie van iNOS- en COX-2-genen te meten. De expressie van de doelgenen werd genormaliseerd ten opzichte van de expressie van GAPDH. De gegevens zijn gemiddelden ± SEM (n=6). (-): zonder LPS, (+): LPS behandeling. # P<0,005 versus controle (-), P<0,05 versus controle (+).

Figuur 5

Effecten van orale toediening van AME op de serumontstekingsreacties na intraperitoneale injectie van LPS. AME (2500 mg/kg) werd gedurende 10 dagen oraal toegediend aan muizen. Serum werd verkregen 1 uur na intraperitoneale injectie van LPS (1.3 mg/kg) en de serumspiegels van TNF-α en IL-6 werden bepaald door ELISA. De gegevens zijn gemiddelden ± SEM (n=10). (-): zonder LPS, (+): LPS behandeling. # P<0,001 versus controle (-), P <0,05, P <0,001 versus controle (+).

3.5. Effecten van orale toediening van AME op T-cel- en B-celpopulaties in de milt en MHC II-expressie

Om te bepalen of orale toediening van AME adaptieve immuuncellen verandert, analyseerden we de percentages van CD4 en CD8 T-cellen en B-cellen in de milt in de controle- en AME-groepen. De CD4(+) T-cel populatie nam significant toe van 23,4% tot 27,2% en 26,9% in de 500 en 2.500 mg/kg groepen, respectievelijk (Figuren 6(a) en 6(d)). Er werden geen verschillen waargenomen in CD8 T-cel en B-cel populaties (Figuren 6(a), 6(b), en 6(d)). MHC klasse II moleculen zijn nodig voor de presentatie van antigenen aan CD4 T cellen. We analyseerden de splenische expressie van de muis MHC klasse II moleculen IA/IE en vonden dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van MHC II moleculen significant steeg van 65,3 tot 68,9 in de 2.500 mg/kg AME groep (Figuren 6(c) en 6(e)). Deze bevindingen suggereren dat AME veranderingen in het adaptieve immuunsysteem induceert.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

3.6. Effecten van orale toediening van AME op T-celproliferatie en Th1/Th2 Cytokinerespons in splenocyten

We onderzochten de functie van splenische T-cellen na behandeling met AME. Splenocyten geïsoleerd uit controle of AME groepen werden gestimuleerd met anti-CD3 antilichaam, een mitogeen dat de gehele populatie van T cellen activeert, ongeacht de antigeen receptor specificiteit. Behandeling met anti-CD3 antilichaam gedurende 48 uur verhoogde de optische dichtheid met een factor 2,6, zoals gemeten door MTS assay. Er was geen verschil in proliferatie geïnduceerd door anti-CD3 antilichaam tussen controle en AME groepen (figuur 7(a)). IFN-γ en IL-4 zijn representatieve cytokines voor Th1 en Th2 cellen, respectievelijk. We evalueerden de secretie van IFN-γ en IL-4 in splenocyten gestimuleerd met anti-CD3 antilichaam. Een significante vermindering van de IFN-γ secretie werd waargenomen in de 500 mg/kg AME groep, terwijl de IL-4 secretie significant toenam in de 2.500 mg/kg groep (Figuur 7(b)). Hoewel er geen dosisafhankelijk effect werd waargenomen, had AME de neiging de Th2-respons te bevorderen.

(a)

(b)

(a)
(b)

4. Discussie

In de traditionele Chinese geneeskunde wordt van Qi-versterkende kruiden verwacht dat ze het immuunsysteem versterken. In deze studie hebben we ons specifiek gericht op de ontstekingsreacties van macrofagen en T-cellen geïsoleerd uit muizen die oraal AME kregen toegediend.

Thioglycollaat-geïnduceerde steriele peritonitis werd voor het eerst geïntroduceerd in 1964 door Gallily et al. en is sindsdien de meest gebruikte methode voor de isolatie van primaire macrofagen . Op dag 4 na intraperitoneale injectie van thioglycollaat is het totale aantal peritoneale exsudaatcellen ongeveer 5-voudig toegenomen. Onder deze cellen zijn macrofagen het overheersende celtype, gevolgd door eosinofielen. De bron van het toegenomen aantal peritoneale macrofagen in met thioglycollaat geïnjecteerde muizen zijn beenmerg-afgeleide bloedmonocyten. Upregulatie van scavenger receptoren treedt op tijdens het proces van monocyt-naar-macrofaag differentiatie . Scavenger receptoren, een type van macrofaag aangeboren receptoren, zijn verantwoordelijk voor fagocytose en herkennen specifiek polyanionische liganden . We gebruikten CD11b en verschillende scavenger receptor markers om monocyt-afgeleide macrofagen in peritoneale exsudaat cellen te identificeren en vonden dat de CD11b(+)SRA(+) cel populatie significant verhoogd was in de AME groep. Dit suggereert dat toediening van AME de rekrutering en differentiatie van bloedmonocyten tot macrofagen bevordert in reactie op thioglycollaat.

LPS wordt herkend door het toll-like receptor (TLR)-4/MD-2 complex. TLR4 induceert een ontstekingsreactie via twee adaptormoleculen, MyD88 en TRIF . De MyD88-afhankelijke signaaltransductieroute activeert NF-κB en mitogeen-geactiveerd proteïnekinase (MAPK) om ontstekingsgenen zoals TNF-α en IL-6 te induceren. De TRIF-afhankelijke signaalroute activeert interferonregulerende factor-3 om IFN-β te produceren, dat nodig is voor de opregulering van costimulatoire moleculen . De TRIF-signaleringsroute neemt ook deel aan de activering van NF-κB en MAPK, maar op een vertraagde manier in vergelijking met de MyD88-afhankelijke route. Upregulatie van costimulatoire moleculen is uitsluitend TRIF-afhankelijk, terwijl ontstekingsreacties co-afhankelijk zijn van MyD88 en TRIF. Er was geen remmend effect op de geteste ontstekingsmarkers in macrofagen van de AME groep. In plaats daarvan was de expressie van CD86 verminderd. CD86 op macrofagen bindt CD28 op Th cellen om de activiteit van Th cellen te versterken. Onze resultaten geven aan dat orale toediening van AME geen invloed heeft op NF-κB- en MAPK-afhankelijke ontstekingsreacties in macrofagen, maar specifiek interfereert met de TRIF-afhankelijke pathway die alleen leidt tot CD86 expressie. Verdere studies zijn nodig om te evalueren of AME veranderingen veroorzaakt in een pathologische situatie waarin macrofagen en Th-cellen overheersen.

Het LPS-gestimuleerde macrofaagsysteem is een zeer gebruikelijk in vitro model voor het evalueren van de ontstekingsremmende activiteit van natuurlijke producten of kandidaat-geneesmiddelen. Met behulp van dit model is het gemakkelijk om het gewenste resultaat te verkrijgen met in lipiden oplosbare componenten, omdat deze gemakkelijk het celmembraan kunnen penetreren. Onze gegevens toonden aan dat peritoneale macrofagen geïsoleerd uit muizen die oraal AME toegediend kregen geen ontstekingsremmende effecten ex vivo vertoonden, hetgeen in tegenspraak is met eerder gerapporteerde in vitro resultaten. Daarentegen werd anti-inflammatoire activiteit van AME waargenomen in de serumrespons van TNF-α en IL-6 na intraperitoneale injectie van LPS. Het is het minst waarschijnlijk dat deze systemische ontstekingsremmende activiteit gemedieerd wordt door de modulatie van macrofagen. Een van de verschillen tussen de in vivo en in vitro omstandigheden is dat LPS in vivo door verscheidene lipoproteïnen in de circulatie wordt gebracht en vervolgens door hepatocyten wordt geklaard, terwijl deze gebeurtenis niet in vitro kan worden nagebootst. LPS klaring kan overstimulatie van de lever macrofagen voorkomen. Of de systemische ontstekingsremmende werking van AME verband houdt met de LPS klaring in de lever moet nog worden vastgesteld. Een soortgelijk resultaat werd verkregen bij peritoneale macrofagen geïsoleerd uit muizen die oraal Astragalus membranaceus water extract toegediend kregen (ongepubliceerde gegevens). Astragalus membranaceus en AM behoren tot dezelfde categorie van Qi-tonificerende kruiden. Op dit moment weten we niet of in vivo ontstekingsremmende activiteit die geen macrofaag modulatie met zich meebrengt uniek is voor deze medicinale planten of een gemeenschappelijke eigenschap die induceerbaar is door Qi-tonificerende medicinale planten, en we moeten meer gegevens verzamelen om conclusies te kunnen trekken. Bovendien rapporteerden Li et al. dat atractylenolide I en 14-acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, een type polyacetylenische verbinding geïsoleerd uit AM, een moleculaire structuur hebben die interageert met membraangebonden glucocorticoid receptor. Volgens hun studie waren 300 mg/kg oraal atractylenolide I en 30 mg/kg oraal polyacetyleen de minimale doses die nodig waren om ontstekingsremmende effecten te vertonen . De hoeveelheid atractylenolide I in 2.500 mg/kg AME bedraagt slechts 0,097 mg/kg, een dosis die ver onder het vereiste minimum ligt. Bovendien moet er tijdens de bereiding van AME verlies van polyacetylenen hebben plaatsgevonden. Het is mogelijk dat AME niet-geïdentificeerde glucocorticoïde-achtige verbindingen bevat die bijdragen aan zijn systemische ontstekingsremmende activiteit.

Een voldoende aantal T-cellen is nodig om een goede immuunrespons te handhaven. Onder normale omstandigheden wordt het totale aantal T-cellen op peil gehouden door de aanmaak van naïeve T-cellen in de thymus en de turnover van perifere naïeve T-cellen en geheugen-T-cellen. Bij muizen en mensen treedt atrofie van de thymus op met het ouder worden, waardoor de productie van naïeve T-cellen bij beide soorten afneemt. Echter, in termen van het onderhoud van naïeve T-cellen, produceren muizen naïeve T-cellen gedurende hun leven, terwijl volwassen mensen deze populatie onderhouden door perifere naïeve T-celdeling . Bovendien is de levensduur van naïeve T-cellen in muizen 40-maal korter dan hun menselijke tegenhangers. Geheugen T-cellen worden in stand gehouden door intermitterende deling. Het precieze overlevings- en homeostatische proliferatiemechanisme van naïeve en geheugen T-cellen is niet volledig gedefinieerd, maar omvat signalen van TCR/MHC complex en cytokines zoals IL-7 en IL-15 . Het langdurige effect van vaccins hangt af van geheugen-T-cellen, terwijl voor de behandeling van lymfopenische aandoeningen naïeve T-cellen nodig zijn. Wij hebben niet bepaald of de splenische CD4 T cel populatie die toenam na AME behandeling bestond uit naïeve CD4 T cellen of uit geheugen CD4 T cellen. Een gedetailleerde karakterisering van de celfractie die reageert op AME zal helpen om te specificeren welke situatie beter geschikt is voor de toepassing van AME.

Opgemerkt moet worden dat gelijktijdige upregulatie van MHC klasse II moleculen in de milt optrad in de AME groep. MHC klasse II moleculen zijn nodig om antigenen te leveren aan CD4 T cellen. Wij vonden routinematig dat de meerderheid van MHC klasse II expresserende cellen in de milt B cellen zijn en de overige cellen macrofagen en dendritische cellen. Wij hebben niet opgehelderd welke celtypes een upregulatie van MHC klasse II moleculen vertoonden na toediening van AME. Desalniettemin wijst de toename van het aantal CD4 T cellen en de expressie van MHC klasse II moleculen in de milt erop dat suppletie van AME bijdraagt aan het systemische onderhoud van CD4 T cellen. De rol van IL-4 onder fysiologische omstandigheden is het versterken van de antilichaamrespons door het bevorderen van de overleving en proliferatie van B-cellen en het bieden van afweer tegen helminth infectie. Splenocyten van de AME groepen vertoonden een verhoogde IL-4 productie tijdens T cel activering ex vivo gelijktijdig met een verlaagde IFN-γ productie. Deze resultaten suggereren dat onder normale omstandigheden AME de Th2 respons bevordert. Daarentegen bevordert orale toediening van AM-afgeleide glycoproteïne de Th1-respons en vermindert het de Th2-respons in een allergisch model. Het is niet duidelijk of deze verbinding de volledige activiteit van AM vertegenwoordigt. Verdere studie is nodig om te bepalen of AME pathologische Th2 reacties voorkomt of verergert.

5. Conclusie

In deze studie hebben we veranderingen waargenomen in de reacties van macrofagen en T-cellen in normale muizen na orale toediening van AME. AME versterkte thioglycollaat-geïnduceerde monocytendifferentiatie in het peritoneum en onderdrukte LPS-geïnduceerde TNF-α en IL-6 niveaus in serum. In tegenstelling tot deze systemische anti-inflammatoire effecten, waren anti-inflammatoire effecten niet duidelijk in macrofagen geïsoleerd uit de AME groep, behalve voor veranderingen in de expressie van costimulatoire moleculen. AME beïnvloedde ook het adaptieve immuunsysteem door het aantal CD4 T-cellen en de expressie van MHC klasse II-moleculen te verhogen en de Th2-respons te bevorderen boven de Th1-respons.

Afkortingen

Beschikbaarheid van gegevens

De gegevens die zijn gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn op verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.

Belangenconflicten

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door het Basic Science Research Program via de National Research Foundation of Korea, gefinancierd door het ministerie van Onderwijs (2014R1A1A2055052).