Results
Efficiënte biotinylering van gemerkt GATA-1 in getransfecteerde cellen. Het schema voor de specifieke in vivo biotinylering van gemerkte eiwitten in zoogdiercellen wordt geschetst in Fig. 1A. Volgens deze procedure wordt een kleine (23 aa) peptide tag gefuseerd met het eiwit van belang en gecoëxpresseerd in cellen samen met BirA, een bacterieel eiwit-biotine ligase (20). De gebruikte peptidetag is eerder geïsoleerd uit een synthetische peptidebibliotheek gescreend op door BirA gemedieerde biotinylering, die specifiek bij het lysineresidu van de tag optreedt (16). Zoeken in de eiwitdatabase heeft geen in de natuur voorkomende eiwitten geïdentificeerd die een sequentiemotief bezitten dat vergelijkbaar is met dat van de peptidetag.
(A) Schema voor de specifieke biotinylering van gelabeld GATA-1 door BirA biotine ligase in MEL cellen. De sequentie van de 23-aa peptide tag gefuseerd met de N-terminus van GATA-1 wordt getoond. De asterisk geeft de lysine residu dat specifiek wordt gebiotinyleerd door BirA. Gestippelde dozen geven de posities van de twee GATA-1 zinkvingers. Gemerkte GATA-1 en BirA werden afzonderlijk in een zoogdier-erythroïde-expressiecassette gekloneerd en gecoëxpresseerd in MEL-cellen. (B) Biotinylering van gemerkt GATA-1 in MEL-cellen. (Links) Western blot met een anti-GATA-1 antilichaam om endogene en gemerkte GATA-1 eiwitten op te sporen. (Rechts) Western blot van dezelfde extracten met streptavidine-HRP conjugaat om gebiotinyleerd GATA-1 te detecteren. Nucleaire extracten (5 μg per lane) van de dubbele transfectanten (lanes 1 en 5) en enkele transfectanten (lanes 2, 3, 6, en 7) voor gemerkte GATA-1 en Bir A werden getest. Lanen 4 en 8, kernextract van nietgetransfecteerde MEL-cellen. Gebiotinyleerd GATA-1 (asterisk) is duidelijk zichtbaar in alleen in de rijstrook van de dubbel getransfecteerde cellen. Ook aangegeven is de lage achtergrond gedetecteerd door streptavidine in MEL kernextracten van cellen die alleen BirA tot expressie brengen (rechts, laan 7). (C) Efficiëntie van biotinylering en binding van GATA-1 aan streptavidinekorrels. (Links) Western blot met anti-GATA-1 antilichaam om binding van gelabeld GATA-1 aan streptavidinekorrels te detecteren (laan 2; het uitgangsmateriaal voor de binding was 2,5 maal de hoeveelheid kernextract in de input laan). Invoer- en ongebonden materiaal worden getoond in lanen 1 en 3. (Rechts) Hetzelfde filter gestript en gereprobeerd met streptavidine-HRP om de binding van gebiotinyleerd GATA-1 aan streptavidinekorrels te detecteren (laan 5). Rij 6 laat zien dat zeer weinig gelabeld GATA-1 ongebonden blijft door streptavidine. Bij dit bindingsexperiment werden de korrels gewassen onder stringente omstandigheden (0,5 M NaCl/0,3% Triton X-100 in PBS). In, input (kernextract); El, geëlueerd materiaal; Un, ongebonden materiaal.
Het eiwit dat we bij het testen van dit systeem hebben getagd, was de essentiële muriene hematopoietische transcriptiefactor GATA-1 (voor bespreking, zie ref. 25). De tag werd gefuseerd N-terminaal aan GATA-1 en uitgedrukt onder de controle van een menselijke β-globine expressie cassette in MEL cellen, die kunnen worden geïnduceerd om terminal erythroid celdifferentiatie (22) te ondergaan. BirA werd ook gekloond en tot expressie gebracht in MEL cellen door gebruik te maken van de menselijke globine expressiecassette. Klonen die overeenkomen met enkele en dubbele stabiele transfectanten voor gemerkte GATA-1 en BirA werden geïsoleerd en in eerste instantie gescreend op expressie van beide constructen. In het geval van GATA-1, Western blot analyse met behulp van een GATA-1 antilichaam detecteert de langzamer migreren gemerkt eiwit en de endogene GATA-1 in de kernextracten van getransfecteerde cellen (Fig. 1B, lanen 1 en 2). Expressie van BirA werd geanalyseerd op RNA-niveau (gegevens niet weergegeven).
We testten vervolgens, op geselecteerde stabiele transfectanten, of het gemerkte GATA-1 eiwit werd gebiotinyleerd door BirA. Testen van nucleaire extracten van MEL celklonen met behulp van een streptavidine-HRP conjugaat toonde een robuust signaal dat overeenkomt met het gemerkte GATA-1 eiwit, alleen detecteerbaar in de rijstrook van de gemerkte GATA-1/BirA dubbele transfectant (Fig. 1B, rijstrook 5). Geen biotinylering van gemerkt GATA-1 is zichtbaar in afwezigheid van BirA (Fig. 1B, laan 6). Deze bevindingen bevestigen dat het BirA-eiwit in een actieve vorm in getransfecteerde MEL-cellen wordt gesynthetiseerd. Bovendien wordt in de kernextracten van MEL-cellen die alleen BirA tot expressie brengen, zeer weinig aspecifieke achtergrondbiotinylering waargenomen (fig. 1B, rijstrook 7). We concluderen daarom dat expressie van bacterieel BirA-eiwit-biotineligase in MEL-cellen specifiek een zoogdiertranscriptiefactor met een uniek peptidetag kan biotinyleren.
We testten vervolgens de efficiëntie van biotinylering door gemerkte GATA-1 in ruwe kernextracten te binden aan streptavidine paramagnetische Dynabeads (Fig. 1C). Uit analyse van het materiaal dat uit de korrels was geëlueerd, bleek dat bijna al het gemerkte GATA-1-eiwit was gebonden (vergelijk rijstrook 2 met rijstroken 1 en 3, Fig. 1C). Herbehandeling van hetzelfde filter met streptavidine-HRP toont ≈100% efficiëntie in de biotinylering en het vangen van gelabeld GATA-1 door de korrels (fig. 1C, lanen 4 en 5). Bovendien is er, in overeenstemming met wat in fig. 1B is gezien, weinig achtergrondbinding van endogeen gebiotinyleerde eiwitten aan de korrels, zoals gedetecteerd met streptavidine-HRP (fig. 1C, rijstrook 5). Deze gegevens tonen aan dat gelabeld GATA-1 zeer efficiënt wordt gebiotinyleerd en teruggewonnen uit extracten door streptavidinebinding, met verwaarloosbare achtergrondbiotinylering.
Single-Step Purification of Biotinylated GATA-1 from Crude Nuclear Extracts by Streptavidin Binding. We onderzochten ook de haalbaarheid van een eenstapszuivering bij het isoleren van gebiotinyleerd GATA-1 uit ruwe kernextracten door directe binding aan streptavidinekorrels onder matige strengheid (150 mM NaCl/0,3% Nonidet P-40/200 ng/μl kippenserumalbumine). Eerst probeerden wij een controlebinding uit 5 mg ruwe kernextracten van MEL-cellen die alleen BirA tot expressie brengen (fig. 2, laan 4). Het geëlueerde materiaal bestond uit ongeveer vijf sterk gekleurde banden tegen een achtergrond van veel zwakkere banden (Fig. 2, laan 5). We identificeerden de achtergrondbindende eiwitten door de hele lane uit de gel te halen en deze te analyseren met vloeistofchromatografie-tandem MS. De aldus geïdentificeerde eiwitten zijn in tabel 1 ingedeeld volgens biologische functie en cellulair compartiment, zoals gedefinieerd door het Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org). Uit de resultaten bleek dat de meest voorkomende geïdentificeerde achtergrondeiwitten de van nature gebiotinyleerde carboxylasen en geassocieerde enzymen waren, die grotendeels samenvielen met de intens verkleurende banden. Wij vonden ook achtergrondbinding van overvloedige nucleaire eiwitten die betrokken zijn bij de verwerking van mRNA, zoals splitsingsfactoren, alsmede van ribosomale eiwitten. Samen waren deze drie klassen van eiwitten goed voor >80% van de achtergrondbinding onder de gebruikte omstandigheden (tabel 1). Het is opmerkelijk dat zeer weinig peptiden werden geïdentificeerd als overeenstemmend met factoren die betrokken zijn bij transcriptieregulatie (Tabel 1). Wij concluderen dat achtergrondbinding aan streptavidinekorrels voornamelijk te wijten is aan endogene gebiotinyleerde eiwitten alsmede overvloedige nucleaire factoren die betrokken zijn bij de verwerking van mRNA en de synthese en assemblage van ribosomen, met zeer weinig niet-specifieke binding van factoren die betrokken zijn bij transcriptieregulering/activering.
Colloïdaalblauw-gekleurde gel van een bindingsexperiment van ruwe kernextracten aan streptavidinekorrels. Rij 1, marker (M). Rij 2, kernextract van gemerkte GATA-1/BirA-dubbelgetransfecteerde cellen (≈12 μg). Rij 3, eiwitten geëlueerd na directe binding aan streptavidinekorrels van ≈5 mg ruw kernextract van getagde GATA-1/BirA-getransfecteerde cellen. Rij 4, inputkernextract van met GATA-1/BirA gemerkte getransfecteerde cellen. Rij 5, geëlueerde eiwitten na binding aan streptavidinekorrels ≈5 mg kernextract van met BirA geïfectioneerde cellen. Pijl in rijstrook 3 geeft eiwit band die gezuiverd gebiotinyleerd GATA-1, zoals bepaald door MS.
- View inline
- View popup
We probeerden vervolgens het binden van een vergelijkbare hoeveelheid ruwe nucleaire extract (5 mg) van gemerkte GATA-1 / BirA dubbele transfectanten, onder dezelfde omstandigheden (Fig. 2, lane 2). Het kleuringpatroon van de laan met het geëlueerde materiaal (Fig. 2, laan 3) was significant verschillend van dat waargenomen met de achtergrondbinding in laan 5, wat wijst op een significante verrijking in eiwitten die coeluderen met gelabeld GATA-1 (Fig. 2, laan 3 vs. laan 5). Gebiotinyleerd GATA-1 en coëlerend eiwit kunnen verdunnen of concurreren voor binding met de niet-specifieke eiwitten waargenomen in laan 5. De eiwitverrijking in rijstrook 3 kan dus overeenkomen met gecopolueerde GATA-1-interagerende eiwitten. In het geëlueerde materiaal zagen we ook een sterk gekleurde band migreren met een grootte die vergelijkbaar is met die verwacht voor gemerkt GATA-1 (Fig. 2, pijl, laan 3). Wij bevestigden de aanwezigheid van GATA-1 in deze band door gel excision en MS. De gedetailleerde analyse van alle eiwitten die copureren met gemerkt GATA-1 zal elders worden gepubliceerd (P.R., F.G., en J.S., ongepubliceerde resultaten). Tezamen tonen deze gegevens de kwantitatieve biotinylering van gemerkte GATA-1 in MEL-cellen en de efficiënte zuivering ervan uit ruwe eiwitextracten in een eenstapsprocedure door directe binding aan streptavidinekorrels, met weinig achtergrondbindingsbanden die hoofdzakelijk overeenkomen met endogeen gebiotinyleerde eiwitten en gemakkelijk identificeerbare overvloedige nucleaire/nucleolaire eiwitten.
Biotinylering heeft geen invloed op de eiwitinteragerende of DNA-bindende eigenschappen van GATA-1. Omdat het mogelijk is dat de toevoeging van de peptide tag en / of biotinylering kan invloed hebben op de eigenschappen van het gemerkte eiwit, hebben we getest of gebiotinyleerd GATA-1 nog steeds eiwit-eiwit interacties met een bekende GATA-1 partner, zoals FOG-1 (26), en of het kan binden in vivo aan bekende GATA-1 gen doelen, zoals de muis βmaj globine promotor. Wij voerden een pull-down experiment uit van gebiotinyleerd GATA-1 door kernextracten aan streptavidinekorrels te binden en testten of FOG-1 ook werd gecopurificeerd. We vonden dat FOG-1 werd neergetrokken uit extracten die gebiotinyleerd GATA-1 tot expressie brachten, maar niet uit extracten die alleen BirA tot expressie brachten (Fig. 3A, lanen 2 en 4). We hebben ook vastgesteld dat FOG-1 copurgeert met gebiotinyleerd GATA-1 door MS. We hebben ook een chromatine pull-down (ChIP) experiment uitgevoerd waarbij gesoniceerd chromatine van formaldehyde-gecrosslinkte MEL cellen werd geïncubeerd met streptavidine korrels, gevolgd door elutie van het gebonden materiaal en recuperatie van het pulled-down DNA. Met behulp van primers specifiek voor de βmaj promoter, vonden we verrijking voor deze sequenties in het DNA getrokken uit het chromatine van cellen die gebiotinyleerd GATA-1, maar niet van cellen die BirA (Fig. 3B). Wij hebben ook vastgesteld dat biotinylering geen invloed heeft op de subnucleaire distributie die normaal met GATA-1 wordt waargenomen (Fig. 5, die als ondersteunende informatie op de PNAS website is gepubliceerd; ref. 27) en dat gebiotinyleerd GATA-1 een identiek biochemisch fractioneringsprofiel vertoont als endogeen GATA-1 in de kernextracten van MEL-cellen (gegevens niet weergegeven). Tezamen leveren deze resultaten sterke aanwijzingen dat de eigenschappen van GATA-1 niet worden beïnvloed door biotinylering. Bovendien tonen deze gegevens ook de toepassing aan van biotinyleringsmarkering als een alternatief voor antilichamen in methoden waarbij een affiniteitszuiveringsstap nodig is, zoals proteïne pull-downs of een ChIP-assay.
(A) Het binden van gebiotinyleerd GATA-1 aan streptavidinekorrels trekt specifiek FOG-1 naar beneden, zoals gedetecteerd door Western blotting met behulp van een FOG-1-antilichaam. Daarentegen kan FOG-1 niet door streptavidine worden aangetrokken in kernextracten waarin alleen BirA wordt gebiotinyleerd (rechts). FOG-1 wordt gedetecteerd als een doublet (26). (B) Streptavidine pull-down van βmaj globine promotor sequenties van crosslinked chromatine van MEL-cellen tot expressie gebracht gebiotinyleerd GATA-1 (links) of BirA alleen (rechts). Driehoeken geven toenemende hoeveelheden pulled-down verknoopt chromatine gebruikt als sjabloon in PCR-reacties in het opsporen van amplificatie van de βmaj sequenties. Specifieke verrijking voor βmaj sequenties wordt waargenomen in pulled-down chromatine van cellen die gebiotinyleerd GATA-1, maar niet van cellen die BirA alleen.
Biotinylering tagging in transgene muizen uitdrukken. De mogelijkheid om direct het biotine-gemerkte eiwit te isoleren uit ruwe extracten in een enkele stap verhoogt het vooruitzicht van het gebruik van deze aanpak voor de zuivering van gemerkte eiwitten uit beperkende bronnen, zoals muisweefsels. Daarom hebben we getest of BirA-gemedieerde biotinylering tagging ook zou werken in vivo in transgene muizen. Omdat GATA-1 overexpressie leidt tot embryonale letaliteit bij muizen (28), hebben we deze aanpak getest door het taggen van de essentiële erytropoëtische transcriptiefactor EKLF (29). Muis EKLF cDNA werd getagd met de biotinylering tag en een dubbele hemagglutinine epitoop en micro-injectie in muizeneieren om transgene muis lijnen te stellen. Op dezelfde wijze werden ook transgene muizenlijnen tot stand gebracht door micro-injectie van het BirA/erythroïde expressiecassette-construct. Transgene muizenlijnen met aantoonbare expressie van gemerkt EKLF en BirA in erythroïde cellen werden geselecteerd en gekruist. In vivo biotinylering van gemerkt EKLF werd beoordeeld in nucleaire extracten bereid uit de foetale levers van 13,5 dagen postcoitum embryo’s. Western blot analyse met een anti-EKLF antilichaam detecteerde zowel endogeen EKLF als gemerkt EKLF, dat gevisualiseerd werd als een doublet (Fig. 4, laan 1). Binding van de foetale lever kernextracten aan streptavidinekorrels laat zien dat alleen de bovenste band in het doublet behouden blijft, wat suggereert dat deze gebiotinyleerd is (fig. 4, lanen 2 en 3). Deze waarneming wordt bevestigd door dezelfde blot met streptavidine-HRP te onderzoeken, waarbij slechts één band wordt gedetecteerd (Fig. 4, lanen 7 en 9). De doublet die door het EKLF-antilichaam wordt gedetecteerd, is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het differentiële gebruik van translatie-initiatiecodons bij de N-terminaal gefuseerde biotinyleringstag (bovenste band) en bij de dubbele hemagglutinine-epitoop die onmiddellijk stroomafwaarts aanwezig is en die ook een initiatiecodon bevat (onderste band). Bijgevolg dient alleen de bovenste band met de biotinyleringstag als substraat voor BirA, waarmee de in vivo specificiteit van deze benadering nog eens wordt aangetoond. De binding van kernextracten aan streptavidinekorrels toonde ook aan dat een aanzienlijk deel (≈50%) van het gemerkte EKLF in de foetale levers van transgene muizen wordt gebiotinyleerd. Wij speculeren dat het verschil in biotinyleringsefficiëntie tussen getransfecteerde cellen en foetale levers (afgezien van het gebruik van verschillende fusie-eiwitten) een in vivo beperking in de beschikbaarheid van biotine (biotine is overvloedig aanwezig in de FCS die wordt gebruikt om celkweekmedia aan te vullen) of een verschil in BirA-expressieniveaus kan weerspiegelen. Deze resultaten tonen aan dat de specifieke biotinylering van gemerkte EKLF door bacteriële BirA ook met hoge efficiëntie in vivo in transgene muizen kan worden bereikt.
Specifieke biotinylering van gemerkte EKLF in transgene muisembryo’s. Nucleaire extracten van de foetale lever van 13,5-dagen postcoitum embryo’s van een gemerkte EKLF/BirA dubbele transgene lijn (lanen 1-3 en 7-9) en van een gemerkte EKLF transgene lijn (lanen 4-6) werden gebonden aan streptavidine korrels. Gemerkt en gebiotinyleerd EKLF in input kernextract, ongebonden materiaal (sup., supernatant), en gebonden materiaal werd gedetecteerd met een EKLF-antilichaam (links) of met streptavidine-HRP (rechts). EKLF biotinylering en binding aan de korrels wordt alleen gedetecteerd in extracten van dubbel transgene embryo’s.