Thiolen reageren met deze verbinding, waarbij de disulfidebinding wordt gesplitst, zodat 2-nitro-5-thiobenzoaat (TNB-) ontstaat, dat bij neutrale en basische pH in water ioniseert tot het dianion TNB2-. Dit TNB2-ion heeft een gele kleur.
Deze reactie verloopt snel en stoichiometrisch, waarbij bij de toevoeging van één mol thiol één mol TNB vrijkomt. De TNB2- wordt gekwantificeerd in een spectrofotometer door de extinctie van zichtbaar licht bij 412 nm te meten, met een extinctiecoëfficiënt van 14.150 M-1 cm-1 voor verdunde bufferoplossingen, en een coëfficiënt van 13.700 M-1 cm-1 voor hoge zoutconcentraties, zoals 6 M guanidiniumhydrochloride of 8 M ureum. Helaas werd de extinctiecoëfficiënt voor verdunde oplossingen in de oorspronkelijke publicatie van 1959 onderschat, namelijk op 13.600 M-1 cm-1, en zoals in een recent artikel werd opgemerkt, is deze fout in de literatuur blijven bestaan. Commerciële DTNB kan niet volledig zuiver zijn, zodat herkristallisatie nodig kan zijn om volledig nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Ellman’s reagens kan worden gebruikt voor het meten van laag-moleculaire massa thiolen zoals glutathione in zowel zuivere oplossingen als biologische monsters, zoals bloed. Het kan ook het aantal thiolgroepen op proteïnen meten.