Om het gebruik van Escher-FBA voor echte toepassingen te demonstreren, presenteren we vier belangrijke FBA voorbeelden die direct in de browser kunnen worden uitgevoerd. Deze zijn afkomstig uit een overzicht van FBA en zijn toepassingen. Deze voorbeelden zijn gebaseerd op het standaard kernmodel van E. coli, dus ze zijn klaar om te worden uitgevoerd zodra de Escher-FBA webpagina wordt geopend. Zorg ervoor dat je tussen elk voorbeeld op de Reset Map knop klikt. Als je problemen hebt met het vinden van een reactie, klik dan op de Zoek optie in het Beeld menu (of de “f” toets op je toetsenbord) om een zoekbalk te openen.
FBA met alternatieve koolstof substraten
Het eerste voorbeeld demonstreert het gebruik van FBA om te voorspellen of groei kan optreden op alternatieve koolstof substraten. Het standaard kernmodel van E. coli bevat een gesimuleerd minimaal medium met D-glucose als koolstofbron. Hier zullen we de koolstofbron veranderen van D-glucose naar succinaat. Plaats eerst de muisaanwijzer op de succinaat-uitwisselingsreactie EX_succ_e en verander de ondergrens in – 10 mmol/gDW/uur, hetzij door de schuifregelaar te verslepen of door – 10 in te voeren in het veld Ondergrens. Beweeg vervolgens de muis over de D-glucose-uitwisselingsreactie EX_glc_e, en verhoog de ondergrens tot 0 of klik op de knop Knockout. De standaarddoelstelling is nog steeds om de groei te maximaliseren, dus deze twee wijzigingen zullen het programma instrueren om de maximale groeisnelheid te berekenen terwijl succinaat als koolstofbron wordt gebruikt in plaats van D-glucose. U zou moeten zien dat de maximale voorspelde groeisnelheid daalt van 0,874 h- 1 tot 0,398 h- 1, wat de lagere groei-opbrengst van E. coli op succinaat weerspiegelt (Fig. 2a). Dit is de algemene benadering voor het maken van veranderingen in Escher-FBA; ga met de muis over de reactie, maak de gewenste veranderingen, en Escher-FBA zal automatisch uw resultaten laten zien. De ondergrenswaarden voor koolstofbronuitwisseling zijn experimentele metingen, dus u kunt proberen de specifieke ondergrenswaarde aan te passen aan realistische waarden voor groei op andere koolstofbronnen.
Voorbeelden van Escher-FBA-simulaties. (a) Gesimuleerde groei met succinaat als enige koolstofbron. (b) Gesimuleerde anaerobe groei op een minimaal glucosemedium. (c) Maximalisatie van ATP-opbrengst in het standaardmodel. (d) Groei van het iMM904-model van S. cerevisiae. Merk op dat de pijlen in het instellingenmenu breder zijn gemaakt om de veranderingen duidelijker te maken
FBA tijdens anaërobe groei
Anaërobe groei kan op dezelfde manier worden gesimuleerd door met de muis over de EX_o2_e-reactie te gaan en ofwel op Knockout te klikken of de ondergrens op 0 te zetten. Als u de zuurstofuitwisseling op nul zet terwijl succinaat nog steeds de enige koolstofbron is, geeft de Flux Through Objective-indicator “Infeasible solution/Dead cell” aan, wat betekent dat groei niet mogelijk is. Probeer op de Reset-knop rechtsonder te klikken om een minimaal medium met D-glucose als koolstofbron te simuleren, klop dan EX_o2_e uit, en de voorspelde groeisnelheid zou 0,211 h- 1 moeten zijn (Fig. 2b).
FBA met samengestelde doelstellingen
Escher-FBA ondersteunt het instellen van meerdere doelstellingen in de modus Samengestelde Doelstellingen. In het standaardmodel schakelt het instellen van een nieuwe doelstelling altijd de vorige uit. Om de modus in te schakelen, klikt u eerst op de knop Samengestelde Doelstellingen onderin het scherm. Een voorbeeld van het gebruik van de modus: om de maximale groeisnelheid te controleren terwijl de flux door SUCDi wordt geminimaliseerd, begint u met de standaarddoelstelling om de biomassaproductie te maximaliseren. Ga dan met de muis over het reactielabel voor SUCDi en klik op de knop Minimize in de tooltip. Rechtsonder ziet u beide doelstellingen opgesomd. Merk op dat alleen doelstellingcoëfficiënten van 1 of – 1 (weergegeven door Maximaliseren en Minimaliseren) momenteel worden ondersteund. Om terug te gaan naar enkelvoudige doelstellingen, klik je weer op de knop Samengestelde Doelstellingen.
Analyse van metabole opbrengsten
We kunnen Escher-FBA ook gebruiken om de maximale opbrengsten van precursors en cofactors zoals ATP te bepalen. Alles wat nodig is, is een stoichiometrisch gebalanceerde reactie die de cofactor van belang verbruikt. De ATP-onderhoudsreactie (ATPM) is zo’n voorbeeld. Om de maximale productie van ATP te bepalen, ga je met de muis over de ATPM-reactie en klik je op de knop Maximaliseren. De doelstelling op deze manier instellen werkt omdat, om de flux door de ATPM-reactie te maximaliseren, het systeem eerst ATP moet produceren in de hoogst mogelijke hoeveelheid. Wanneer ATPM gemaximaliseerd wordt in het standaard kernmetabolismemodel van E. coli, is de objectieve waarde 175 mmol/gDW/uur. (Fig. 2c). Met succinaat als koolstofbron daalt deze waarde tot 82,5 mmol/gDW/uur. Dezelfde procedure kan worden gevolgd voor elke gewenste metaboliet door een stoichiometrisch uitgebalanceerde verbruiksreactie te creëren en het model zo in te stellen dat de flux door die reactie gemaximaliseerd wordt. Merk op dat het momenteel niet mogelijk is om zo’n reactie automatisch in Escher-FBA te maken, maar dit kan in een toekomstige versie worden toegevoegd.
Fluxvariabiliteitsanalyse
Analyseren van alternatieve optimale oplossingen in metabolisme is een andere nuttige toepassing van FBA . Aangezien de oplossingen die door FBA worden geproduceerd vaak niet uniek zijn, kan het nuttig zijn om het bereik van fluxwaarden te kennen die een bepaalde reactie kan hebben. Flux variabiliteitsanalyse (FVA) wordt vaak gebruikt om deze bandbreedtes over het hele netwerk te berekenen. Escher-FBA ondersteunt FVA berekeningen niet direct, maar het is wel mogelijk om ze voor een bepaalde reactie te berekenen. Klik daarvoor eerst met de muis op de doelfunctie (de biomassa reactie Biomassa_Ecoli_kern_w_GAM) en stel de boven- en ondergrens in op iets minder dan de huidige fluxwaarde (in de standaard kaart, probeer 0.870). Ga vervolgens met de muis over een reactie van belang en klik op de knoppen Maximaliseren en Minimaliseren om de maximale en minimale flux door die reactie te zien, gegeven de optimale groeisnelheid. Het maximaliseren en minimaliseren van de flux door GAPD in de glycolyse levert bijvoorbeeld een haalbaar fluxbereik van 15,44-16,68 mmol/gDW/uur op, wat aangeeft dat de glycolytische flux bij hoge groeisnelheden sterk beperkt is. Anderzijds levert het maximaliseren en minimaliseren van de flux door MALS in de glyoxylate shunt een haalbaar fluxbereik op van 0-2.64 mmol/gDW/hr., wat aangeeft dat de glyoxylate shunt zowel actief als inactief kan zijn bij hoge groeisnelheden. Deze procedure kan met om het even welke reeks reacties worden uitgevoerd en de gebruiker kan zijn systeem tot om het even welk aantal fluxwaarden beperken om het gamma van oplossingen te zien dat voor een bepaalde reactie beschikbaar is.
Gebruik van andere genoomschaalmodellen
Het standaard E. coli kernmodel is niet het enige systeem dat kan worden gesimuleerd. Indien men bijvoorbeeld simulaties op een gistcel wenst uit te voeren, kan een model en een kaart voor Saccharomyces cerevisiae worden gedownload van http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. Klik op die pagina op de download knop voor het model (iMM904.json) en de kaart (iMM904.Central carbon metabolism.json). Laad deze in Escher-FBA door te klikken op Laad Kaart JSON in het Kaart menu en Laad Model JSON in het Model menu om beide JSON bestanden te laden. Eenmaal geladen is de kaart klaar om bewerkt en gesimuleerd te worden met elk gereedschap in Escher of Escher-FBA (Fig. 2d). Bij een groter model zoals iMM904 zullen niet alle reacties tegelijk zichtbaar zijn, maar u kunt wel een reactie aan de visualisatie toevoegen. Klik eerst op het moersleutel-icoontje op de zijbalk of selecteer Reactie toevoegen in het menu Bewerken. Nu kunnen reacties worden toegevoegd door ergens op de kaart te klikken en de gewenste reactie te selecteren uit het drop down menu. Het tekst invoerveld kan worden gebruikt om te zoeken naar een reactie van belang.
Toepassing van Escher-FBA op microbiële cel fabriek ontwerp
Om een voorbeeld te geven van een onderzoek hypothese die kan worden getest met behulp van Escher-FBA, laadden we genoom-schaal modellen van E. coli met twee routes om 1-propanol te produceren voor chemische productie. Deze routes zijn onlangs geanalyseerd in een studie over de voorspellende kracht van genoom-schaal modellen voor het simuleren van echte microbiële cel fabriek stammen . Het eerste model omvat een enkele route naar 1-propanol productie (Additional file 1) voor het eerst gerapporteerd door Atsumi et al. Het tweede model omvat twee synergetische routes voor 1-propanolproductie (Additional file 2) voor het eerst gerapporteerd door Shen en Liao . Elk model kan afzonderlijk worden geladen (met de Model > Laad COBRA model JSON menu-knop), en een enkele kaart van het centrale metabolisme wordt geleverd die compatibel is met beide modellen (Additional file 3, kan worden geladen met Map > Laad Kaart JSON).
We waren benieuwd of de synergetische aanpak voor 1-propanol productie – waarvan bekend is dat deze een hogere productie-opbrengst heeft – ook een verschil heeft in het vereiste padgebruik. Daarom hebben we elk model afzonderlijk geladen, de uitscheiding van 1-propanol gemaximaliseerd (ga met de muis over EX_1poh_e en klik op Maximaliseren), de ondergrens voor uitscheiding op 99% van het maximum gezet, en vervolgens de flux door de eerste geëngageerde stap van de pentosefosfaatroute, glucose 6-fosfaat dehydrogenase (G6PDH2r), geminimaliseerd. De resulterende kaarten tonen aan dat de synergetische routes voor de productie van 1-propanol stoichiometrisch in evenwicht zijn met de glycolyse, zodat zij geen PPP-activiteit vereisen (Fig. 3b). Anderzijds vereist de individuele pathway een aanzienlijke PPP flux (Fig. 3a). Ook ander padgebruik, zoals de benodigde TCA-flux voor elk geval, kan op deze kaarten worden onderzocht.
Padwaygebruik voor twee heterologe routes naar de productie van 1-propanol in E. coli. De pentosefosfaatroute (PPP)-flux die voor elke heterologe productieroute nodig is, kan worden vergeleken door ten eerste de productie van 1-propanol te forceren tot 99% van de maximumwaarde (door de ondergrens van de 1-propanoluitwisselingsreactie vast te stellen) en ten tweede de flux door de eerste stap in de PPP te minimaliseren. (a) De 1-propanolroute die door Atsumi et al. is beschreven, maakt gebruik van één enkel traject om 1-propanol te produceren. Het vereist een aanzienlijke PPP-flux en heeft een lagere totale opbrengst. (b) De door Shen en Liao beschreven route maakt synergetisch gebruik van twee routes om een hogere opbrengst te verkrijgen. De route is stoichiometrisch in evenwicht met de glycolyse, zodat er geen PPP-flux nodig is
Terwijl Escher-FBA al voor veel FBA-simulaties direct in de webbrowser kan worden gebruikt, kunnen een aantal van de voorbeelden die Orth et al. presenteren momenteel niet met Escher-FBA worden uitgevoerd. Op dit moment kan Escher-FBA geen functies uitvoeren zoals gen knock-out analyse of robuustheidsanalyse. Escher-FBA gebruikt echter flexibele SVG representaties voor visuele elementen, dus robuustheidsanalyse en zelfs grafische functies zoals fasevlakken kunnen worden toegevoegd. We hebben een routekaart voor de ontwikkeling van Escher-FBA (beschikbaar op de homepage https://sbrg.github.io/escher-fba) en een iteratief ontwikkelingsproces om uiteindelijk complexe systeembiologische analyse in de web browser mogelijk te maken.