Study population
Dit onderzoek is gebaseerd op de HAPIEE cohorten (Health, Alcohol and Psychosocial factors in Eastern Europe) uit Polen, Tsjechië, en Litouwen , en de 8-jaar follow-up van het Duitse ESTHER cohort (Duitse naam: “Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung”) .
De totale HAPIEE-studie omvat cohorten in vier landen. Aangezien het niet mogelijk was bloedmonsters uit Rusland te exporteren, werden slechts drie cohorten in de huidige analyse opgenomen. Deelnemers aan de studie werden gerekruteerd in zes Tsjechische steden (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec, en Usti nad Labem) in 2002-2005 (n = 8 857), in Krakau, Polen, in 2002-2005 (n = 10 728), en in Kaunas, Litouwen, in 2006-2008 (n = 7 161). Elk cohort bestaat uit een aselecte steekproef van mannen en vrouwen, in de leeftijd van 45-75 jaar bij aanvang, gestratificeerd naar geslacht en leeftijdsgroepen van 5 jaar, geselecteerd uit bevolkingsregisters. De totale respons bedroeg 61%. De gegevens werden verzameld door middel van een vragenlijst en een kort onderzoek in een kliniek waarbij een nuchter veneus bloedmonster werd genomen.
De ESTHER-studie is een cohort van 9.949 volwassenen, in de leeftijd van 50-74 jaar bij aanvang, gerekruteerd door hun huisartsen (GP) tijdens een routine gezondheidscontrole tussen 2000 en 2002 in de Duitse deelstaat Saarland . Het huidige onderzoek is gebaseerd op de 8-jarige follow-up, uitgevoerd tussen juli 2008 en december 2010, waarbij de deelnemers aan de studie tussen 56 en 85 jaar oud waren. Van de basislijn tot de 8-jaar follow-up waren 499 personen overleden, 505 personen waren niet langer in staat om deel te nemen vanwege een slechte gezondheid, en 680 hadden verdere deelname geweigerd. Van de resterende 8.265 deelnemers stuurden 6.061 een vragenlijst terug (respons 73,4%) en 4.637 doneerden een bloedmonster in de praktijk van hun huisarts. De huisartsen van de deelnemers aan de studie vulden ook een vragenlijst in over de gezondheidstoestand van de deelnemers aan de studie (beschikbaar voor n = 5.997). Bovendien stemden 3.124 studiedeelnemers in met een extra geriatrische beoordeling van 3 uur, uitgevoerd door studieartsen bij de deelnemers thuis.
Variabelen in de ESTHER en HAPIEE studies werden geharmoniseerd en oxidatieve stress markers werden gemeten in het kader van het Consortium on Health and Ageing: Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES; www.chancesfp7.eu), dat elders is beschreven. De studies zijn uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van Helsinki en van alle deelnemers aan de studie is schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen.
Ethiek, toestemming en toestemmingen
De geïncludeerde studies werden goedgekeurd door de respectievelijke lokale ethische commissies (ESTHER: Medische Faculteit van de Universiteit van Heidelberg en de Medische Vereniging van Saarland; HAPIEE: University College London (Groot-Brittannië), Nationaal Instituut voor Volksgezondheid (Praag, Tsjechië), Jagiellonian Universiteit (Krakau, Polen), en Litouwse Universiteit van Gezondheidswetenschappen (Kaunas, Litouwen)). Schriftelijke geïnformeerde toestemming is verkregen van alle deelnemers in de geanalyseerde studies en de studies worden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.
Covariate assessment
In de ESTHER en HAPIEE studies, werden sociodemografische, levensstijl, en geschiedenis van ziekte gegevens beoordeeld door middel van zelf in te vullen vragenlijsten. Lengte en gewicht werden gemeten en aangevuld met zelfgerapporteerde informatie in ESTHER voor die studiedeelnemers die niet instemden met het huisbezoek. Naast zelfgerapporteerde informatie werd de geschiedenis van veel voorkomende chronische ziekten in de ESTHER studie gevalideerd door het raadplegen van medische dossiers of de Saarland kankerregistratie. Nierinsufficiëntie werd gedefinieerd als een geschatte glomerulaire filtratiesnelheid <60 mL/min/1,73 m2, berekend met de op creatinine gebaseerde Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration-vergelijking. In het ESTHER-cohort werden serumcreatinineconcentraties bepaald met een kinetische Jaffé-methode op een Cobas 8000 C701 (analyt: CREJ2 3000, Roche). Totaal cholesterol en high-density lipoproteïne cholesterol (HDL) werden in serummonsters bepaald door enzymatische chromatografie (analyten: Chol2 2100, HDLC3 450, Roche) en C-reactief proteïne (CRP) door immunoturbidimetrie op de Cobas 8000 C701 (analyten: CRPL3 500, Roche). In HAPIEE werden het totale en HDL-cholesterol ook beoordeeld met dezelfde testmethode en analyten van Roche, maar er werden verschillende auto-analyzers gebruikt (HAPIEE Tsjechië en Litouwen: Roche Cobas Mira; HAPIEE Polen: Hitachi 917/Modular P). Bovendien werden in alle HAPIEE-cohorten serumcreatinine en CRP beoordeeld met dezelfde analysemethode als in ESTHER, maar met analyten van een andere leverancier (Beckman-Coulter) en op een andere auto-analyzer (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).
Vaststelling van sterfte
Voor deze analyses gebruikten we follow-up voor totale sterfte door officiële landelijke (Tsjechië, Duitsland), lokale (Litouwen), of regionale sterfte registers (Polen) tot 31 december 2010, in Polen, 31 december 2011, in Tsjechië en Litouwen, en tot 31 juli 2014, in Duitsland. Oorzaak-specifieke mortaliteit in Duitsland was alleen beschikbaar voor sterfgevallen die plaatsvonden tot 2 april 2013. De registers waren volledig voor alle deelnemers die niet buiten de bestreken regio van het register waren verhuisd. Het verlies aan follow-up door migratie was 4 % in de HAPIEE-cohorten (gecombineerd) en 2 % in de ESTHER-studie. Alle sterfgevallen die werden gecodeerd met de ICD-10-codes I00-I99 werden beschouwd als cardiovasculaire sterfgevallen en sterfgevallen door kanker werden gedefinieerd met de ICD-10-codes C00-C97.
Oxidatieve stress serum marker meting
De assays gebruikt om d-ROMs niveaus (Diacron, Grosseto, Italië) en TTL (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Turkije) te meten werden aangepast aan een auto-analyzer (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Nederland) in het Laboratorium voor Gezondheidsbeschermingsonderzoek (Bilthoven, Nederland), zoals eerder beschreven . De d-ROMs assay meet de hydroperoxideconcentratie in Carratelli Units (Carr U), genoemd naar de uitvinder van de assay, Mauro Carratelli. Elke Carr U komt overeen met 0,08 mg waterstofperoxide (H2O2)/100 mL in het monster. De TTL-test meet de concentratie van vrije thiolgroepen in het monster in μmol/L.
Metingen werden uitgevoerd in serummonsters die ongeveer 3-10 jaar waren bewaard in vriezers met -80 °C. d-ROMs en TTL hebben een goede stabiliteit op lange termijn onder deze omstandigheden . In de ESTHER-follow-up van 8 jaar werden d-ROM’s en TTL gemeten bij alle deelnemers die bloed afgaven bij hun huisarts (n = 4.637). De metingen werden echter op twee verschillende tijdstippen uitgevoerd omdat de financiering niet beschikbaar was om alle monsters te meten in de pilotstudie die in juni 2012 werd uitgevoerd . Om te corrigeren voor mogelijke verschuivingen in de assays, werden 80 monsters van tijdspunt 1 (juni 2012) opnieuw gemeten op tijdspunt 2 (september 2014) en werden lineaire regressievergelijkingen verkregen en gebruikt om de resultaten van tijdspunt 2 te standaardiseren naar de niveaus van tijdspunt 1, toen de metingen in de HAPIEE-cohorten ook plaatsvonden (gedurende het hele jaar 2012). De overeenstemming van de d-ROM-metingen was hoog (Spearman correlatiecoëfficiënt r = 0,92 en verschil van gemiddelden = 15 Carr U) en daarom werden geen correcties toegepast. Voor TTL werd een duidelijke verschuiving in de assayresultaten (r = 0,88 en verschil van gemiddelden = 81 μmol/L) gecorrigeerd door de volgende vergelijking toe te passen op alle metingen van tijdstip 2: TTLtijdstip2 = 0,746 × TTLtijdstip1. Bovendien hebben we 610 metingen van bloedmonsters die niet voldeden aan de strikte hemolytische, icterische en lipemische kwaliteitscriteria van de ESTHER-studie uitgesloten, zodat er 4 027 overbleven voor analyse in de huidige studie. In de HAPIEE-cohorten was het aantal monsters dat niet aan deze kwaliteitscriteria voldeed te verwaarlozen.
Analytische studiesteekproef
Omwille van beperkte financiering werden niet bij alle deelnemers in de HAPIEE-cohorten d-ROMs-niveaus en TTL gemeten; in plaats daarvan werd een gematchte case-control-opzet aangenomen (Additional file 1: figuur S1). Gevallen werden gedefinieerd als alle personen die overleden tijdens de follow-up (n = 1.433) of die een incident niet-fataal myocardinfarct (MI) of beroerte (n = 658) doormaakten. Controles (n = 4.396) werden qua frequentie gematcht met de gevallen naar geslacht en 5-jarige leeftijdsgroepen. Om de oversampling voor MI en beroerte in deze mortaliteitsanalyse te corrigeren, werden personen met niet-fatale MI of niet-fatale beroerte tijdens de follow-up in een eerste stap uit de gevallen verwijderd. Om een representatieve steekproef van personen met niet-fatale incidenten van MI of beroerte aan de controles toe te voegen, werd in een tweede stap de waargenomen proportie van niet-fatale incidenten van MI of beroerte in elk leeftijds- en geslachtsspecifiek stratum in het totale cohort berekend. In een derde stap werden deze percentages vermenigvuldigd met de steekproefomvang in elk stratum bij de controles met gemeten oxidatieve stress-markers. In een vierde stap werden de resulterende aantallen in elk stratum willekeurig geselecteerd uit de groep van personen met niet-fatale incident MI of beroerte en toegevoegd aan de controles, wat resulteerde in een pool van 4.552 in aanmerking komende controles voor de 1.433 sterfgevallen. In de laatste stap werd de pool van in aanmerking komende controles gebruikt om individueel precies twee controles te matchen met elk sterfgeval op cohort, geslacht en leeftijd (±5 jaar).
Statistische analyses
Verschillen in baseline kenmerken tussen gevallen (overlijden tijdens follow-up) en controles werden beoordeeld met de χ2-test voor categorische variabelen en de Wilcoxon rank-sum test voor continue variabelen. Cross-sectionele associaties van vastgestelde risicofactoren voor sterfte met hoge oxidatieve stress niveaus werden beoordeeld met logistische regressie modellen die alle baseline karakteristieken gemodelleerd als categorische variabelen (Tabel 1). De afhankelijke variabele “hoge oxidatieve stress” werd gedefinieerd aan de hand van twee verschillende definities gebaseerd op d-ROMs niveaus of TTL. Voor d-ROMs werd, volgens de instructies van de fabrikant, een klinische cut-off van >400 Carr U gebruikt, waardoor 23 % van het ESTHER-cohort en 30 % van de in aanmerking komende controles van het HAPIEE-cohort in de categorie “hoge” oxidatieve stress werden ingedeeld. Voor TTL zijn geen klinische cut-offs beschikbaar en aangezien de test nog niet is gestandaardiseerd, varieerden de populatiegemiddelden sterk tussen de cohorten. Daarom werd, om het aandeel personen met hoge oxidatieve stress volgens de definitie op basis van d-ROMs-niveaus te evenaren, het laagste cohort-specifieke TTL-kwartiel (25%) gebruikt om de personen in een hoge oxidatieve stresscategorie op basis van TTL in te delen. De cross-sectionele analyses werden uitgevoerd bij alle proefpersonen en afzonderlijk voor vrouwen en mannen.
Voor longitudinale analyses, Cox proportionele hazard regressie (ESTHER cohort) en conditionele logistische regressie (HAPIEE gematchte case-control studie) werden gebruikt om hazard ratio’s en odds ratio’s te schatten, respectievelijk, voor een toename in d-ROMs niveaus en afname in TTL met één cohort-specifieke standaarddeviatie (SD). Bovendien werden d-ROMs niveaus ook gemodelleerd als een categorische variabele, met door de fabrikant aanbevolen klinische cut-offs voor matige (341-400 Carr U), hoge (401-500 Carr U) en zeer hoge oxidatieve stress (>500 Carr U) met verwijzing naar proefpersonen met niet verhoogde of lage oxidatieve stress (≤340 Carr U). Wanneer het absolute risico laag is, leveren logistische en Cox regressie gewoonlijk vergelijkbare resultaten op en kan de odds ratio worden beschouwd als een benadering van de meer nauwkeurige hazard ratio. Wij gebruikten de term relatief risico (RR) voor beide effectschattingen. In een sensitiviteitsanalyse werden analyses van de oorzaakspecifieke mortaliteit in het ESTHER-cohort uitgevoerd rekening houdend met het concurrerende risico van overlijden door andere oorzaken, door een proportioneel subdistributie hazards regressiemodel te passen met gewichten voor proefpersonen die de concurrerende risicogebeurtenis ondergingen volgens een uitbreiding van de Fine and Gray methode . De resultaten waren echter vrijwel identiek met de traditionele Cox proportionele hazard regressie en daarom worden alleen de laatstgenoemde resultaten in dit manuscript getoond.
De analyses werden voor elk cohort afzonderlijk uitgevoerd en gepoold door middel van een meta-analyse met Mantel-Haenszel weging en willekeurige effecten , rekening houdend met de steekproefgrootte van de cohorten en de mogelijkheid van statistische heterogeniteit tussen de studies. Dit laatste werd onderzocht met de Q-test van Cochrane en de I2-statistiek.
De volgende uitkomsten werden geanalyseerd: sterfte aan alle oorzaken, CVD, kanker en niet-CVD, niet-kanker oorzaken. Voor elke uitkomst werden vier statistische modellen ontwikkeld, met een toenemende opname van gevestigde risicofactoren voor sterfte in de modellen. Zowel d-ROMs-niveaus als TTL werden steeds in hetzelfde model opgenomen omdat hun correlatie laag was (r <0,08 in elk cohort). In model 1 werd gecorrigeerd voor leeftijd en geslacht in het ESTHER-cohort, terwijl dit niet nodig was voor de HAPIEE-cohorten omdat de gevallen individueel werden gematcht met twee controles naar leeftijd en geslacht en geanalyseerd in gestratificeerde analyse waarbij de strata bestaan uit de verzameling gematchte sets. Model 2 corrigeerde bovendien voor opleiding, body mass index (BMI), roken, alcoholgebruik en lichaamsbeweging. Model 3 omvatte ook ziekten die de associatie van oxidatieve stress met mortaliteit zouden kunnen mediëren (d.w.z. dyslipidemie (beoordeeld naar totaal en HDL-cholesterol), nierfunctiestoornissen, een voorgeschiedenis van diabetes, hypertensie, MI, beroerte, en kanker). Ten slotte werd model 4 nog aangepast voor CRP-niveaus, die sterk gecorreleerd waren met d-ROMs-niveaus (r = 0,34-0,41 in de cohorten) en, minder sterk, met TTL (r = 0,11-0,17 in de cohorten). Leeftijd werd gemodelleerd als een continue variabele en alle andere variabelen werden gemodelleerd als categorische variabelen (de categorieën staan vermeld in tabel 1). We testten op interacties tussen d-ROMs/TTL met covariaten door geschikte interactietermen toe te voegen aan model 2.
De te analyseren subgroepen werden a priori gekozen met het doel te stratificeren voor de belangrijkste potentiële determinanten van hoge oxidatieve stress niveaus: cohort/land, leeftijd, geslacht, voorgeschiedenis van MI of kanker, en ontstekingsstatus. Wegens beperkingen van de steekproef werden de gestratificeerde analyses beperkt tot sterfte aan alle oorzaken, CVD en kanker. Om de mogelijkheid van omgekeerde oorzakelijke vertekening te voorkomen, werden de analyses afzonderlijk uitgevoerd voor gebeurtenissen in de jaren 1-2, 3-4 en 5-6 van de follow-up. Wegens beperkingen van de steekproefomvang kon deze gestratificeerde analyse alleen worden uitgevoerd voor sterfte door alle oorzaken. Om modelinstabiliteit te vermijden, werd een cohort-specifiek subgroepanalyseresultaat alleen in aanmerking genomen voor meta-analyse wanneer ten minste 25 voorvallen optraden in de subgroep.
Multiple imputation werd gebruikt om het aantal ontbrekende baseline covariate waarden toe te schrijven, zoals weergegeven in Additional file 1: Tabel S1. Het aandeel ontbrekende waarden was minder dan 5% voor alle variabelen, met uitzondering van alcoholgebruik en lichamelijke activiteit, die tot 22% ontbrekende waarden hadden. Voor zover ons bekend ontbraken de gegevens willekeurig, wat de veronderstelling is van de meervoudige imputatie. Afzonderlijk per cohort, casestatus en geslacht werden 20 volledige gegevensreeksen geïmputeerd met de SAS 9.3-procedure “PROC MI”, waarbij gebruik werd gemaakt van de Markov chain Monte Carlo-methode. Variabelen uit het “volledige” model werden gebruikt voor het imputatiemodel. Alle multivariabele analyses werden uitgevoerd in de 20 geïmputeerde gegevensreeksen en de resultaten van de afzonderlijke gegevensreeksen werden gecombineerd met de SAS 9.3-procedure “PROC MIANALYZE”.
De meta-analyses werden uitgevoerd met de statistische software Comprehensive Meta-Analysis 2.0 (Biostat, Englewood, NJ, USA). Alle andere analyses werden uitgevoerd met SAS, versie 9.2 (Cary, North Carolina, VS). Alle statistische tests waren tweezijdig, met een alfa-niveau van 0,05.