Tabel 1
Excitatie, emissie en helderheid
Als u van plan bent meerdere fluorescentielabels te gebruiken, is het belangrijk dat u er een kiest met verschillende emissiepieken – en excitatiepieken die u kunt richten met uw beschikbare lasers. Als de emissiepieken elkaar overlappen, zal het moeilijk of zelfs onmogelijk zijn ze te onderscheiden.
U wilt doorgaans de helderste fluorescerende tag binnen uw beschikbare spectra om een duidelijk signaal te verkrijgen en elke potentiële achtergrondfluorescentie te overwinnen. Helderheidswaarden zijn een product van de extinctiecoëfficiënt van het eiwit en de kwantumopbrengst. Het resulterende getal kan echter moeilijk te interpreteren zijn en daarom is de helderheid van een fluorescerend label ten opzichte van een goed gedefinieerd label, zoals EGFP, een gebruikelijke alternatieve maatstaf.
Maturatie en bleken
Maturatie bepaalt hoe lang het duurt voordat een fluorescerend label correct is gevouwen, de chromofoor is gevormd en begint te fluoresceren. Voor tijdgevoelige gebeurtenissen in levende cellen kan een korte rijpingstijd belangrijk zijn. Superfolder GFP (sfGFP) bijvoorbeeld kan in minder dan 10 minuten vouwen, terwijl mOrange meer dan vier uur kan duren.
Bleaching is een maat voor de fotostabiliteit, d.w.z. hoe lang na excitatie de chromofoor het vermogen verliest om licht uit te zenden. Als u van plan bent langdurige time-lapse-experimenten uit te voeren, overweeg dan een tag met een hoge fotostabiliteit. T-sapphire heeft een bleking halveringstijd (t½; tijd voor een initiële emissiesnelheid van x fotonen/s om te halveren) van 25 seconden, maar EGFP is veel stabieler, met een bleking t½ van 174 seconden.
Milieuomstandigheden
Zoals de meeste eiwitten worden fluorescerende tags beïnvloed door pH, temperatuur en zuurstofniveaus. Afhankelijk van de omgeving die u van plan bent te gebruiken, moet u wellicht de omstandigheden enigszins aanpassen of een geschiktere tag selecteren.
De pH kan van invloed zijn op excitatie- en emissiepieken, en de meeste fluorescentietags zijn gevoelig voor zuur: sommige kunnen zelfs van fluorescentie-intensiteit veranderen bij pH-veranderingen (bijv. pHTomato). De pKa-waarde is een goede indicator voor de pH-gevoeligheid, omdat deze aangeeft bij welke pH de helft van de chromoforen fluorescerend is.
Daarnaast hebben temperatuur en zuurstofgehalte beide invloed op de rijpingstijd: hypoxische omstandigheden hebben de neiging de rijpingstijd te vertragen, evenals temperaturen buiten het optimale bereik van de fluorescente tags (bv. EGFP is geoptimaliseerd om te werken bij 37°C). Nieuwere fluorescentielabels zoals UnaG, een GFP geïsoleerd uit de Japanse zoetwaterpaling (Anguilla japonica), fluoresceren echter zelfs wanneer het zuurstofgehalte laag is3.
Codon-optimalisatie
Aangezien de meeste fluorescente tags zijn afgeleid van kwallen- of koraaleiwitten, en niet van cellen en weefsels van zoogdieren waarin je ze waarschijnlijk zult gebruiken, kan er een interspecies verschil zijn in de gebruikte aminozuurcodons. Dit kan leiden tot een slechte expressie en dus een laag signaal.
Gelukkig zijn veel van de nieuwere versies van fluorescerende tags codon-geoptimaliseerd om de voorkeuren van zoogdiercellen weer te geven. In GFP bijvoorbeeld, Jürgen Haas en collega’s verbeterde het signaal 40-120 keer door wijziging van de GFP codonsequentie4.
Als u een oudere plasmide gebruikt om uw fusie-eiwitten te genereren, kan het zijn dat deze geen gewijzigde fluorescente tagsequentie bevat. Controleer daarom altijd of uw sequentie is aangepast voor gebruik in een bepaalde diersoort.
Oligomerisatie
Het is belangrijk om te bepalen of uw tag een monomeer of een dimeer is (monomeren worden meestal aangeduid met een “m” als voorvoegsel voor de naam van het eiwit, bijvoorbeeld mCherry), en of dit uw experiment al dan niet beïnvloedt. Veel van de vroege fluorescente tags waren geneigd oligomeren te vormen, en oligomerisatie kan de biologische functie van het fusie-eiwit beïnvloeden. EGFP, bijvoorbeeld, is een monomeer dat dimeren kan vormen wanneer gebruikt in hoog genoeg concentraties, die subcellulaire organellen5 kan vervormen of verstoren experimenten zoals FRET6. Echt monomere FP’s worden in de overgrote meerderheid van de gevallen aanbevolen.
GFP- en mCherry-producten