Zowel gedenatureerd als natief BR kan zich binden aan GroEL
Centraal in het mechanisme van de activiteit van GroEL is zijn vermogen om een uiteenlopende reeks polypeptiden te herkennen, voornamelijk door interacties tussen de hydrofobe residuen van het substraat en schroefjes H en I op de apicale domeinen van GroEL (Fig. 1A) (Coyle et al. 1997). Hier werd de binding van zowel gedenatureerd als natief BR aan GroEL eerst onderzocht met isotherme titratie calorimetrie (ITC), omdat elke toestand overvloedig hydrofobe oppervlakteresiduen heeft die gemakkelijk toegankelijk zijn voor GroEL. Zoals in fig. 2A te zien is, levert titratie van GroEL met BR in beide gevallen exotherme titratie-thermogrammen op. De warmte veranderingen zijn specifiek te wijten aan binding van BR aan GroEL als opeenvolgende injectie van BR in de assay buffers zonder de chaperonine produceert vlakke thermogrammen (supplementaire Fig. S1). Warmte van elke injectie getoond in Fig. 2A werd geïntegreerd, gecorrigeerd door de verdunningswarmte, en werd uitgezet tegen de molaire verhouding van BR: GroEL (Fig. 2B). De warmteverandering past bij één set bindingsmodellen (rode en blauwe curven), wat een dissociatieconstante (Kd) oplevert van ongeveer 0,3 nmol/L voor gedenatureerd BR en ongeveer 6,0 nmol/L voor natief BR, respectievelijk (tabel 1). De denaturatie van BR verhoogt dus de bindingsaffiniteit van GroEL voor dit membraaneiwit met een orde van grootte. Anderzijds wordt de binding van beide BR-monsters aangedreven door een gunstige enthalpieverandering (ΔH) en tegengesteld door een negatieve entropieverandering (ΔS); de bindingsstoichiometrie (N) die in beide gevallen wordt bepaald, ligt dicht bij de eenheid (tabel 1). De binding van het natieve BR is echter duidelijk minder enthalpisch met minder entropiecompensatie.
BR-binding aan GroEL beoordeeld met ITC. A Titratie van GroEL met SDS-gedenatureerd BR (dBR, rood) of natief BR (nBR, blauw). Thermogrammen zijn bij 20 °C opgenomen met een MicroCal ITC200-instrument. B Warmte-uitwisseling van elke injectie in A werd geïntegreerd en uitgezet tegen de BR: GroEL molaire verhouding. De ononderbroken lijnen geven de fit van de gegevens aan een model met één set locaties (alle locaties identiek en equivalent) en de verkregen thermodynamische parameters staan vermeld in tabel 1
De dekselvormige co-chaperonine GroES is een essentiële component in GroEL-gemedieerde eiwitvouwing in bacteriën, en er is aangetoond dat het dezelfde bindingsplaatsen op GroEL deelt met het substraat (Chen en Sigler 1999). Titratie van GroEL met gedenatureerd BR in aanwezigheid van GroES wijst uit dat GroES weinig effect heeft op de BR-binding (supplementaire Fig. S2 en Tabel 1). Dit resultaat kan worden begrepen door rekening te houden met Kd, die voor de vorming van een GroEL/ES-complex eerder werd vastgesteld op 3 μmol/L en aanzienlijk hoger is dan die van het hier bepaalde BR-GroEL-complex (Behlke et al. 1997). Dit wijst op een veel zwakkere interactie van de twee chaperonine-eiwitten en is dus in overeenstemming met het niet-significante effect. In aanwezigheid van ATP, dat in vivo de bindingsen loslaatcycli van GroEL en GroES regelt, zou de affiniteit van GroEL/ES echter drie orden van grootte toenemen (normaal Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), theoretisch in staat om te concurreren met BR-binding aan GroEL. Effect van apoGroEL op BR-vouwing en vervolgens de rol van GroES en ATP in dit proces werden vervolgens onderzocht.
GroEL-GroES systeem kan BR-vouwing moduleren in aanwezigheid van DDM
Een deel van SDS-gedenatureerd BR werd waargenomen opnieuw te vouwen wanneer het werd verdund met een overmaat van het oplosbare detergens n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), zoals bleek uit het meten van het herstel van de retinale absorptie (supplementaire Fig. S3) (Booth 1997). Er was geen significant herstel waarneembaar in de assay-buffer zonder detergent of aangevuld met GroEL alleen. Echter, in aanwezigheid van DDM, de toevoeging van GroEL toonde een duidelijk effect op BR vouwen (supplementaire Fig. S3). Snelheidsconstante voor de GroEL (0,15 umol / L) -gemedieerde vouwen, zoals beoordeeld door aanpassing met enkele exponentiële kinetiek, werd geschat op ~ twee keer lager dan de spontane vouwen. GroEL is bekend dat typisch vertragen de vouwing van oplosbare eiwitten die efficiënt kan vouwen in zijn afwezigheid. Dit is verklaard door een competitie tussen intramoleculaire vouwing en intermoleculaire binding aan GroEL (Gray en Fersht 1993; Itzhaki et al. 1995). Het lijkt zeer aannemelijk dat GroEL zich op soortgelijke wijze gedraagt bij het opnieuw vouwen van gedenatureerd BR. Wanneer de concentratie van GroEL werd verhoogd tot 0,30 umol / L, de geschatte snelheidsconstante niet duidelijk veranderd, terwijl de opbrengst van vouwen bereikte een veel hoger niveau dan de spontane vouwen na 60 min (supplementaire Fig. S3). Deze gegevens tonen aan dat apoGroEL BR vouwsnelheid kan verlagen, maar de opbrengst van het gevouwen protein.
Omdat bacteriële cellen bevatten enkele millimolars van ATP en onder normale omstandigheden, de relatieve molaire verhouding van GroES versus GroEL is 1,9 en na een hitteschok 4,7 (Moparthi et al. 2013); GroEL zal waarschijnlijk niet lang blijven zonder binding ATP en GroES. In aanwezigheid van ATP (blauw in Fig. 3A) was het herstel van correct gevouwen BR aanzienlijk sneller en groter in vergelijking met dat met apoGroEL alleen of het spontane proces (rood en zwart in Fig. 3A). In tegenstelling, de combinatie van GroEL en GroES toonde weinig effect op de snelheid van spontane vouwen, maar verminderde de opbrengst tot op zekere hoogte (Fig. 3A, cyaan). Dit wijst op een interactie tussen GroEL en GroES zonder behoefte aan ATP, waarschijnlijk geïnduceerd door BR gebonden aan GroEL, die op zijn beurt een negatief effect had op het herstel van correct gevouwen eiwit. Wanneer het volledige chaperonine systeem werd gebruikt (Fig. 3A, groen), werd maximale snelheidsverhoging waargenomen, maar de vouwing opbrengst viel tussen de twee voorgaande gevallen.
Tijdsverloop van BR vouwen gemoduleerd door ATP-afhankelijke GroEL-GroES systeem. A Het herstel van gevouwen BR werd continu gecontroleerd met absorptie bij 554 nm. De volgende toevoegingen werden gemaakt: geen (zwart); 0,3 umol / L GroEL (rood); 0,3 umol / L GroEL en 5 mmol / L ATP (blauw); 0,3 umol / L GroEL en 0,6 umol / L GroES (cyaan); 0,3 umol / L GroEL, 0,6 umol / L GroES en 5 mmol / L ATP (groen). B Net GroEL-gemedieerde BR vouwen werd eerst uitgevoerd, dan op T = 60 min het monster werd aangevuld met alleen ATP, met alleen GroES, of met beide zoals aangegeven. C Ter vergelijking met A, het effect van niet-cyclische single-ring (SR1) versie van GroEL op BR vouwen werd ook geanalyseerd. De concentraties van SR1, GroES, en ATP gebruikt waren 0,6 umol / L, 1,2 umol / L, en 5 mmol / L, respectievelijk. D De effecten van GroEL/ES plus ATP op de natieve vouw van BR werden onderzocht door het volgen van de absorptieverandering bij 560 nm. De concentraties van chaperonine en nucleotide gebruikt in B en D waren dezelfde als in A. BR werd gehouden op 2,4 umol / L in alle experimenten. De blauwe en groene lijnen in A en de blauwe lijn in C vertegenwoordigen de fit van de gegevens aan drie-fase exponentiële vergelijking, terwijl de overige lijnen zijn de fit met enkele exponentiële vergelijking. Alle lijnen in B en D zijn eenvoudige hulplijnen
Uit bovenstaande resultaten blijkt dat ATP en GroES de GroEL-gemedieerde BR-vouwing op een verschillende manier kunnen beïnvloeden. GroES-binding aan GroEL is enigszins nadelig voor de vouwing, in tegenstelling tot de bekende positieve rol van substraatinkapseling in de GroEL/ES-kooi voor de geassisteerde vouwing (Jewett and Shea 2010). Vervolgens vroegen wij ons af hoe dit nadelige effect werd geproduceerd. Intrigerend genoeg vergemakkelijkte GroES alleen of de mobiele lussequentie waarmee GroES zich aan GroEL bindt ook het herstel van gevouwen BR (supplementaire Fig. S4). Bovendien is de lus sequentie toonde een effect vergelijkbaar met GroES in de GroEL-gemedieerde vouwen in de afwezigheid en aanwezigheid van ATP (supplementaire Fig. S4). Hoewel het niet kan vormen een verzegelde kap boven de GroEL centrale holte als GroES, wat impliceert een belangrijke bijdrage van de lus-GroEL interactie aan de vouwing. Opmerkelijk is dat de hydrofobe residuen aan het apicale oppervlak van de GroEL die betrokken zijn bij de binding van de mobiele lus van GroES, grotendeels overlappen met de residuen die betrokken zijn bij de binding van het substraateiwit (Motojima et al. 2000). Het is onwaarschijnlijk dat de hydrofobe BR door de mobiele lus in de hydrofiele GroEL/ES-kooi terecht is gekomen, vooral gezien de aanwezigheid van DDM-micellen buiten de kooi, die het vouwen of oplossen van BR nog zou bevorderen. Bij voorkeur, zoals aangetoond voor de geassisteerde vouwing van diverse oplosbare eiwitten (Motojima en Yoshida 2010), kan BR worden gevangen in de buurt van de GroEL/ES-interface, die gedeeltelijk naar buiten uitsteekt wanneer in deze studie het gehele systeem of zelfs alleen GroEL/ES werd gebruikt. Een dergelijke interactie kan BR verhinderen toegang te krijgen tot de gunstige DDM-micellen, wat resulteert in de verminderde vouwopbrengst die is waargenomen met zowel GroES als zijn mobiele loop.
Echter, sommige studies suggereren dat de rol van ATP en GroES alleen is om kleverige substraten (dat wil zeggen, met een Kd in de nmol / L regio hier bepaald), die de geassisteerde vouwsnelheid beperken of zelfs de vouwactiviteit van GroEL remmen indien niet verwijderd (Priya et al. 2013). Om te testen of GroES en ATP tonen een soortgelijk effect in geassisteerde BR vouwen, hebben we eerst geïncubeerd apoGroEL met gedenatureerde BR gedurende 60 min, dan hebben we toegevoegd GroEL of / en ATP (Fig. 3B). De daaropvolgende toevoeging van een component verder bevorderd BR vouwen, maar was minder effectief dan de gelijktijdige toevoeging van beide, waaruit blijkt synergisme tussen de twee op het helpen van de GroEL-gemedieerde vouwen. Anisotropie metingen met BR transmembraan peptiden, die werden gebruikt als mimetica voor gedenatureerde BR om de complicaties geïntroduceerd door de dynamische aard van gedenatureerde BR en van GroEL-BR interacties te omzeilen, bleek dat alleen de combinatie van ATP en GroES in staat was efficiënt scheiden van de voorgevormde peptide-GroEL complex (supplementaire Fig. S5). Het lijkt er dus op dat zowel GroES als ATP nodig zijn om de BR-conformeren met hoge affiniteit te scheiden en de vastgelopen GroEL-bindingsplaatsen (of katalytische plaatsen) te regenereren.
Om het effect van GroES en ATP op de GroEL-gemedieerde BR-vouwing verder te onderzoeken, gebruikten we een enkel-ring GroEL-mutant (SR1) die een stabiel complex vormt met GroES (Weissman et al. 1995), in tegenstelling tot het cyclische GroEL-GroES-systeem. Vergelijkbaar met onze waarneming met GroEL, ATP verhoogde de snelheid en de opbrengst van SR1-gemedieerde vouwen (blauw in Fig. 3C), terwijl de aanwezigheid van GroES verminderde beide aspecten aanzienlijk (cyaan) in vergelijking met het geval met apoSR1 alleen of de spontane proces (rood of zwart). Aangezien gedenatureerde BR werd vastgesteld door ITC te binden aan SR1 met een stoichiometrie in de buurt van eenheid (supplementaire Fig. S2), en SR1 gebruikt was twee keer de concentratie van GroEL, speculeren we dat er meer BR-SR1 complexen gevormd dan BR-GroEL, waarbij GroES meer invloed op de vouwing (cyaan) uitgeoefend. Zoals verwacht had de toevoeging van zowel ATP als GroES geen significant effect op het BR-herstel (groen), wat toe te schrijven is aan de irreversibele binding van GroES aan SR1 in aanwezigheid van ATP (Weissman et al. 1995). Bovendien wijst dit resultaat erop dat de maximale snelheidsverhoging die met GroEL wordt waargenomen, het gevolg is van ATP-gestuurde meervoudige cycli van binding en loslating van GroES.
GroEL alleen of in combinatie met ATP of/en GroES vertoonde een verwaarloosbare invloed op de structuur van natief BR dat met DDM werd gesolubiliseerd (Fig. 3D), hetgeen wijst op een sterkere intramoleculaire interactie binnen het natieve eiwit dan intermoleculaire binding aan GroEL. Aldus is de chaperonine-gemedieerde overgang van BR van de metastabiele gedenatureerde toestand naar de natieve toestand thermodynamisch gunstig.
Aanwijzingen voor zowel de chaperonine-gemedieerde disaggregatie en ontvouwing
Het meten van de spontane BR vouwen bij verschillende concentraties toont aan dat aggregatie resulteerde in slechts gedeeltelijk herstel van correct gevouwen BR en de schijnbare snelheid was concentratie-onafhankelijk, wat impliceert dat aggregatie onomkeerbaar was (supplementaire Fig. S6). In de afwezigheid van oplosbaar detergens DDM, SDS-gedenatureerde BR werd geschat door fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) een diffusiecoëfficiënt (~ 67 um2 / s) veel lager dan gebonden aan GroEL (~ 104 um2 / s) (Fig. 4) hebben. Dit geeft aan dat de aggregaten gevormd door de gedenatureerde BR zijn nog groter dan de BR-GroEL complex met een binding stoichiometrie bijna eenheid zoals bepaald door ITC. Dit betekent ook dat GroEL in staat was de aggregatiestructuur te verstoren, waardoor in wezen de productieve vouwroute met monomere BR werd gepompt. Bovendien werd vastgesteld dat de met DDM gesolubleerde nBR een diffusiecoëfficiënt van ~117 μm2/s heeft, die groter is dan die van dBR met GroEL en veel groter dan die van dBR alleen (Fig. 4). Dit suggereert dat nBR goed gedispergeerd was in aanwezigheid van DDM en ondersteunt ook het idee van GroEL-gemedieerde disaggregatie van dBR. Bovendien, wanneer het volledige chaperonine systeem werd toegevoegd aan gedenatureerd BR, waren witte vlokachtige precipitaten onmiddellijk zichtbaar (gegevens niet weergegeven), wat duidt op gedwongen ontvouwing en synergisme tussen GroES en ATP in dit aspect. Zonder oplosbare detergenten of lipiden die biologische membranen nabootsen in de bulkoplossing, zou ontvouwen BR onmiddellijk aggregeren en neerslaan, in tegenstelling tot de aanzienlijke vouwsnelheid toename waargenomen in de aanwezigheid van DDM.
FCS meting van gedenatureerde BR in de afwezigheid of aanwezigheid van GroEL in vergelijking met natieve BR. Fluorescentie autocorrelatie amplitudes G(τ) van Alexa Fluor 488 fluorescentie werd getoond voor SDS-gedenatureerde BR alleen of met een overmaat van GroEL in afwezigheid van oplosbaar detergens of natieve BR opgelost met DDM. Diffusiecoëfficiënten (D) werden verkregen door het passen van de auto-correlatiecurve met Eq. 1. De standaardafwijkingen waren van drie onafhankelijke metingen
Membraanintegratie van BR gemedieerd door GroEL-GroES
Om te bepalen of en hoe GroEL-GroES de integratie van BR in de bilaag zou ondersteunen, werden omgekeerde cytoplasmamembraandeeltjes (IMV’s) bereid uit Escherichia. coli cellen en vermengd met gedenatureerd BR in aanwezigheid en afwezigheid van apoGroEL, of met ATP/GroES (Fig. 5A). ApoGroEL veroorzaakte een onbetekenende verandering in het herstel van correct gevouwen BR in IMVs, zoals gemeten door UV-Vis spectroscopie (zwart en rood). Anders dan bij de hervouwing in DDM micellen, bleek toevoeging van GroEL en ATP nadelig te zijn voor de membraaninsertie (blauw), terwijl GroEL gecombineerd met GroES dit proces vergemakkelijkte (cyaan). De werkelijke reden voor dit reproduceerbare verschil is niet bekend, maar de stijfheid van IMV’s en de structurele verandering van GroEL-gebonden BR geïnduceerd door ATP of GroES binding zouden mogelijke redenen kunnen zijn. Met name van ATP-binding door GroEL is bekend dat het een uitbreiding van de opening naar de holte van het chaperonine veroorzaakt (Skjaerven et al. 2015). Deze verandering is merkbaarder dan de verandering die alleen wordt veroorzaakt door binding van GroES aan GroEL (Kim et al. 2005), waardoor het mogelijk wordt dat het gebonden substraat zich ontvouwt (Lin et al. 2008; Sharma et al. 2008), wat gunstig is voor productieve vouwing in een geschikt oplosmiddel. Echter, in tegenstelling tot DDM micellen die is zeer dynamisch, IMVs was waarschijnlijk niet in staat om onmiddellijk beschermen de ontvouwen BR soorten en tijdig een gunstige vouwen micro-omgeving. Ter vergelijking, de zwakke vereniging van GroES met GroEL in de afwezigheid van ATP zou kunnen BR leveren aan de bereide IMVs in een efficiëntere manier. Echter, vergelijkbaar met de omvouwing in DDM micellen, de volledige GroEL-GroES systeem sterk verbeterde het membraan insertie van BR (groen), die een steady state snel bereikt met de hoeveelheid herstelde BR vallen tussen de twee voorgaande gevallen.
Insertie van BR in IMVs gemedieerd door de GroEL-GroES systeem. A Invoeging en / of omvouwing van gedenatureerde BR (2,4 umol / L) in IMVs werden voortdurend gecontroleerd met absorptie bij 554 nm. De volgende toevoegingen werden gedaan: geen (zwart); 0,3 umol / L GroEL (rood); 0,3 umol / L GroEL en 5 mmol / L ATP (blauw); 0,3 umol / L GroEL en 0,6 umol / L GroES (cyaan); 0,3 umol / L GroEL, 0,6 umol / L GroES en 5 mmol / L ATP (groen). B Native BR kan efficiënt worden overgebracht naar IMV’s in aanwezigheid van GroEL met de hulp van ATP en GroES. De geteste concentraties van natief BR, GroEL, GroES en ATP waren respectievelijk 0,4, 5, 10 μmol/L en 5 mmol/L
Volgende fluorescentie-anisotropie werd gebruikt om de effecten van de bacteriële chaperoninen op de invoeging van BR in IMV’s (fig. 5B) te onderzoeken. Wanneer fluorescent gelabeld natief BR werd gemengd met een te grote hoeveelheid GroEL, verschoof de anisotropie naar een hogere waarde, wat aantoont dat het membraaneiwit een stabiel complex met de chaperonine vormde. Belangrijk is dat de daaropvolgende toevoeging van IMV’s leidde tot een verdere toename van de anisotropie, wat duidt op de integratie van BR in IMV’s. ATP en GroES bleken de overdracht van BR naar het membraan verder te versterken, zoals ook blijkt uit de toename van de anisotropie. Deze resultaten doen vermoeden dat GroEL, samen met GroES en ATP, een directe rol kan spelen bij de integratie van eiwitten in de lipide bilaag in vivo.