Kinetisch beperkte differentiële centrifugatie als goedkoop en gemakkelijk verkrijgbaar alternatief voor centrifugale elutriatie

In veel toepassingen is het gewenst doelcellen te scheiden van mengsels die andere cellen bevatten met een vergelijkbare dichtheid, maar van verschillende grootte (enigszins of sterk). Voorbeelden hiervan zijn het kweken van gesynchroniseerde celculturen, waarbij cellen in een bepaald stadium van hun cyclus (gekenmerkt door hun grootte) worden geïsoleerd (1-2), het isoleren van corticotropen van andere hypofysecellen (3) en het sorteren van verschillende subpopulaties van monocyten (4). De methode bij uitstek voor het scheiden van celpopulaties op basis van verschillen in sedimentatiesnelheid (vooral wanneer de verschillen in dichtheid niet significant zijn) is een proces dat centrifugale elutriatie wordt genoemd (5). Hierbij worden de separanden (meestal cellen) onderworpen aan twee krachten: (i) een centrifugale kracht die hen doet bezinken met een snelheid die een functie is van hun dichtheid en grootte, en ii) een convectiestroom in de tegenovergestelde richting die alle cellen een vaste snelheid geeft. De stroming en/of de centrifugatiesnelheid kunnen worden aangepast om alleen de cellen te verzamelen waarvan de sedimentatiesnelheid binnen een bepaald bereik valt. Hoewel dit proces ook met succes is gebruikt om bacteriële cellen te scheiden van matrices waarin zij aanwezig zijn (6) (onze toepassing van belang), de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur dient als een belemmering voor veel laboratoria.

Hoewel er een aantal protocollen die zijn beschreven voor het isoleren van bacteriën uit verschillende matrices zoals voedsel (7-8), bodem (9), en microbiële matten (10) die gebruik maken van gemakkelijk verkrijgbare benchtop centrifuges om cellen te scheiden op basis van verschillende sedimentatie snelheden, de aanbevolen protocollen vaak lijken te zijn ad hoc. Zo bevelen Wang et al. (8) bij het isoleren van bacteriën uit zachte kaas centrifugering aan bij <1000×g gedurende een niet nader gespecificeerde tijd om debris te verwijderen, gevolgd door centrifugering bij 9000×g gedurende 3 min om de bacteriën te verzamelen. Evenzo adviseerden Neiderhauser et al. (7) voor het isoleren van bacteriën uit gehomogeniseerd vlees centrifugatie bij 100×g (gedurende onbepaalde tijd) om voedseldeeltjes te verwijderen, gevolgd door centrifugatie bij 3000×g (eveneens gedurende onbepaalde tijd) om bacteriën te verzamelen. In andere gevallen omvatten de aanbevolen protocollen meerdere centrifugatierondes. Zo bevelen Bey et al. (10) voor het isoleren van bacteriën uit microbiële matten niet alleen centrifugering bij 500×g gedurende 15 minuten aan, maar ook resuspensie van het sediment en een viervoudige herhaling van de procedure. Op soortgelijke wijze beveelt Bakken (9) voor het isoleren van bacteriën uit grond aan het homogenaat van het monster herhaaldelijk (gedurende een “aantal malen”) te centrifugeren bij 630-1060×g (gedurende een niet nader gespecificeerde tijd), gevolgd door resuspensie en rehomogenisatie. Soortgelijke benaderingen zijn ook voorgesteld om bacteriën te isoleren uit “positieve” bloedkweekbouillon. Om zuivere isolaten van bacteriën te verkrijgen alvorens hun identiteit te bepalen met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie, gebruikten Stevenson e.a. (11) een centrifugeerprocedure in meerdere stappen met opeenvolgende centrifugeerstappen gedurende “1-2 minuten” elk bij 8500, 1000 en 13.000 omwentelingen per minuut (waarde in g niet gespecificeerd) met resuspensie van de pellet in verschillende buffers bij elke stap.

De genoemde protocollen zijn zeker niet de enige voorbeelden van ad hoc centrifugatieprotocollen die worden gekenmerkt door een kennelijk willekeurige keuze van centrifugatiesnelheden en/of -tijden. Een belangrijk gevolg van dergelijke ad hoc protocollen is dat zij geen rationele basis bieden waarmee anderen protocollen kunnen uitwerken om verschillende doelcellen te isoleren uit andere matrices/mengsels van cellen. Zo is het intuïtief duidelijk dat bij langdurig centrifugeren alle deeltjes bezinken, terwijl bij kort centrifugeren alleen de snelste deeltjes bezinken en de meeste langzamere deeltjes in de suspensie achterblijven. Het bepalen van de optimale snelheid/duur voor het centrifugeren om het doeldeeltje te isoleren en andere deeltjes te elimineren, blijft echter meer een kunst. Met andere woorden, de momenteel gerapporteerde protocollen bieden geen rationele basis voor wijziging (bepaling van optimale centrifugatiesnelheden/-tijden) voor andere verwante scheidings-/isolatiedoelstellingen.

Materialen en methoden

Theorie

De door ons voorgestelde methode om twee deeltjes-types te scheiden die een vergelijkbare dichtheid hebben, maar verschillende sedimentatiesnelheden vanwege grootteverschillen, wordt geïllustreerd in figuur 1. Aan het begin van het proces (figuur 1(1)) wordt de suspensie (bloedkweekbouillon, in ons geval) die de partikels (witte bloedcellen of WBC’s, rode bloedcellen of RBC’s, bloedplaatjes en bacteriën) bevat, als een afzonderlijke laag bovenop een heldere dichte buffer (Histopaque 1083, in ons geval) gebracht. De dichtheid van de buffer is groter dan die van WBC’s (ρ = 1,06 – 1,08 g/mL (12)) en bloedplaatjes (ρ = 1,05 – 1,07 g/mL (13)), maar lager dan die van RBC’s (ρ = 1,1 g/mL (14)) en bacteriën (ρ = 1,105 g/mL voor Escherichia coli (15)). Tijdens het centrifugeren worden alle deeltjes naar beneden gestuwd, eerst door de bovenste laag (het bloedkweekmedium), en vervolgens in de dichte buffer (de Histopaque). Terwijl deeltjes met een hogere dichtheid dan die van de buffer (RBC’s en bacteriën) zowel door de bloedkweekbouillon als door de dichte buffer sedimenteren, worden minder dichte deeltjes (WBC’s en bloedplaatjes) uit laatstgenoemde buffer geweerd. Dit proces is vergelijkbaar met het protocol dat wordt aanbevolen voor het scheiden van WBC’s en bloedplaatjes uit volbloed (16). Voor ons doel echter is dit proces alleen onvoldoende omdat, terwijl sommige ongewenste deeltjes (WBC’s en bloedplaatjes) worden gestript van de doeldeeltjes (bacteriën) op basis van dichtheidsverschillen, andere deeltjes met een vergelijkbare dichtheid (RBC’s) blijven. Om ons doel te bereiken, namelijk alle doelcellen (bacteriën) te verzamelen en tegelijkertijd alle resterende ongewenste deeltjes (RBC’s) te elimineren, stellen wij voor het systeem in de in figuur 1(4) afgebeelde toestand te brengen en het centrifugeerproces daar te stoppen. In deze toestand worden alle RBC’s, die door hun grotere omvang een hogere bezinkingssnelheid hebben, als pellet op de bodem van de buis afgezet, terwijl alle bacteriecellen in de dichte buffer worden gedispergeerd.

Om deze gewenste toestand te bereiken, moet echter aan een aantal beperkingen worden voldaan. Ten eerste moeten we, om ervoor te zorgen dat alle bacteriën in de buffer worden verzameld, de bacteriën die bovenaan zijn begonnen (vlak A) voldoende tijd gunnen om door de laag bloedkweekbouillon (medium 1) en in het Histopaque (medium 2) te migreren. Wiskundig betekent dit:

waarbij, t de tijd is gedurende welke het centrifugatieproces wordt uitgevoerd, l1 de lengte is van de kolom geladen bloedkweekbouillon, en vb1 de sedimentatiesnelheid is van de bacteriën in deze laag. Dit tijdstip (wanneer bacteriën die op vlak A beginnen, net vlak B zijn overgestoken en in de buffer terechtkomen) is afgebeeld in figuur 1(2).

Een ander opvallend kenmerk van deze toestand is dat de bacteriën en de RBC’s tegen die tijd wellicht nog geen afzonderlijke “banden” in de buffer hebben gevormd. Terwijl RBC’s die op een bepaald horizontaal vlak beginnen verder migreren dan bacteriën die zich op dezelfde plaats bevinden, is het mogelijk dat RBC’s die op vlak A zijn begonnen, de bacteriën die op vlak B (grensvlak tussen de twee vloeistoffen) zijn begonnen, nog niet hebben ingehaald. Om dit te laten gebeuren en ervoor te zorgen dat de RBC’s en bacteriën in de buffer afzonderlijke banden vormen, moet de bufferkolom lang genoeg zijn. Er kunnen zich geen afzonderlijke banden vormen als de bufferkolom bijvoorbeeld slechts zo diep is als het niveau dat wordt aangegeven door de stippellijn in figuur 1(2). Mathematisch kan de voorwaarde dat de RBC’s (sneller bezinkende deeltjes) die bij vlak A beginnen de bacteriën (langzamer bezinkende deeltjes) die bij vlak B beginnen inhalen, als volgt worden uitgedrukt

waarbij l1 en l2 de lengten zijn van de kolommen bloedkweekbouillon (Medium 1) en buffer (Medium 2), respectievelijk; vR1 en vR2 zijn de sedimentatiesnelheden van de RBC’s in de bouillon en de buffer, respectievelijk; en vb2 is de sedimentatiesnelheid van de bacteriën in de buffer. Bovenstaande vergelijking kan als volgt worden herschikt:

Bovendien is het wenselijk dat alle bacteriën die oorspronkelijk in medium 1 aanwezig waren, in medium 2 worden verzameld. Dit betekent dat tegen de tijd dat de bacteriën die bovenaan beginnen (vlak A) het grensvlak tussen de twee fasen (vlak B) overschrijden, de bacteriën die bij vlak B beginnen de bodem nog niet mogen hebben bereikt. Wiskundig wordt deze voorwaarde uitgedrukt als:

waarbij vb1 de sedimentatiesnelheid is van de bacteriën in medium 1. Het bovenstaande kan als volgt worden herschikt:

Als aan vergelijkingen (3) en (5) wordt voldaan, zal het systeem de in figuur 1(4) afgebeelde toestand bereiken, waarin alle RBC’s de bodem van de buis hebben bereikt en een afzonderlijke laag vormen, maar geen van de bacteriën dit heeft gedaan. (Zij bevinden zich allemaal in medium 2). Deze toestand treedt voor het eerst op wanneer alle RBC’s (zelfs die welke bij vlak A beginnen) de bodem van de buis hebben bereikt. Wiskundig kan dat tijdstip (t1) als volgt worden weergegeven:

De toestand houdt op te bestaan wanneer de bacteriën (die welke aanvankelijk op het grensvlak, d.w.z. op vlak B, aanwezig waren) de bodem van de buis beginnen te bereiken. De tijd dat dit gebeurt (t2) wordt gegeven door:

Om een optimale scheiding te verkrijgen, moet men dus i) ervoor zorgen dat de kolomlengten van de twee media voldoen aan vergelijkingen (3) en (5); en ii) ervoor zorgen dat de duur van het sedimentatieproces (tcentrifugatie) wordt gegeven door:

Als de centrifugatie langer dan t2 wordt voortgezet, ontstaat de in figuur 1(5) afgebeelde situatie, waarin sommige of alle bacteriën ook naar de bodem sedimenteren. Om zuivere isolaten van de gewenste soort te verkrijgen moet het centrifugeerproces worden gestopt in het stadium dat overeenkomt met figuur 1(4), moet de bovenste laag worden weggegooid en moet de dichte buffer worden opgezogen zonder het sediment op de bodem te verstoren. Indien gewenst kunnen de doeldeeltjes worden gecentrifugeerd en geresuspendeerd in andere media.

Dit “werkvenster” tussen t1 en t2 is schematisch weergegeven in figuur 2. Hier, de abscis toont de tijd van centrifugatie, terwijl de ordinaat toont de fractie van RBC en bacteriële deeltjes die aanwezig zijn in de dichte buffer (Medium 2). Voor beide geldt dat de fractie aanvankelijk toeneemt wanneer zij vanuit de bovenste laag naar binnen migreren, enige tijd constant blijft wanneer zij als een band door de dichte buffer migreren, en tenslotte afneemt wanneer zij zich op de bodem vastzetten. Sneller bewegende RBC’s hebben een steilere stijging/daling, en ook een kortere periode wanneer ze allemaal in de dichte buffer aanwezig zijn. Tijdens het “werkingsvenster” (bewolkt vak) zijn vrijwel alle bacteriën (∼100%) in de buffer aanwezig, maar vrijwel geen RBC’s (∼ 0%).

De sedimentatiesnelheden van de RBC’s en de bacteriën (die de numerieke waarden bepalen van de beperkingen die worden gegeven door vergelijkingen 3,5 en 8) kunnen worden voorspeld op basis van hun respectieve vormen, grootten en dichtheden. De sedimentatiesnelheid van wordt gegeven (17) door de vergelijking:

waarin, ρ en ρl de dichtheden van respectievelijk het deeltje en de vloeistof zijn, µ de viscositeit van de vloeistof is, R de effectieve straal van het deeltje is, en g de versnelling ten gevolge van de zwaartekracht/centrifugatie is. E. coli zijn staafvormige bacteriën, 2 micron lang en 0,5 micron in diameter (18). We kunnen ze dus modelleren als prolate sferoïden, waarvan de effectieve sedimentatiestraal (R) wordt gegeven (19) door:

waarbij a, en b de halve lengten van de hoofd- en nevenas zijn. Voor E. coli geldt dus dat a = 1 micron en b = 0,25 micron. Op basis van deze waarden verwachten we dat E. coli een sedimentatiesnelheid van 26,7 micron/seconde door de bovenste vloeistof heeft, en een snelheid van 6,56 micron/seconde door de Histopaque 1083.

Menselijke RBC’s daarentegen zijn biconcave schijven, 7-8 micron in diameter en 2 micron dik (20). Zij kunnen dus worden gemodelleerd als afgeplatte sferoïden waarvan de effectieve sedimentatiestraal wordt gegeven (19) door:

waarbij a en b de halve lengte zijn van respectievelijk de hoofd- en de nevenas. Met waarden van 4 micron voor a, en 1 micron voor b, voorspellen we dat bij centrifugeren met ons instrument, een Eppendorf-5804, bij een relatieve centrifugale kracht van 400×g, de RBC’s met een snelheid van 500 micron/seconde door de toplaag met dichtheid ∼1,02 g/mL (zoals gemeten door de Eppendorf-5804) zullen sedimenteren.02 g/mL (zoals door ons gemeten), en 101 micron/seconde door de Histopaque (dichtheid = 1,083 g/mL).

De bezinkingssnelheid van deeltjes kan nauwkeuriger worden voorspeld door rekening te houden met deeltjes-deeltjesinteracties. Deze deeltjes-deeltjesinteracties ontstaan wanneer vloeistof die door een bezinkend deeltje naar boven wordt verplaatst, inslaat op andere deeltjes direct achter of naast het eerste, waardoor de vloeistofweerstand van de laatste toeneemt en daardoor de effectieve (gemiddelde) bezinksnelheid van de deeltjes als groep afneemt. Dit fenomeen wordt “belemmerde bezinking” genoemd en moet in rekening worden gebracht wanneer de volumefractie van deeltjes niet verwaarloosbaar is. Er zijn een aantal semi-analytische of empirische uitdrukkingen beschikbaar om de effectieve bezinkingssnelheden te berekenen voor systemen met gehinderde bezinking (21). Een van die benaderingen is de Richardson-Zaki-correlatie, waarbij de effectieve bezinkingssnelheid (v′) wordt gegeven door:

waarin v de bezinksnelheid van het deeltje in het niet-gehinderde geval is, en φ de volumefractie van de deeltjes. Bloed wordt meestal verdund in een bloedkweekbouillon met een verdunning van 1:4 (22). Aangezien de hematocriet (volumefractie van RBC’s in bloed) gewoonlijk ongeveer 0,4-0,45 bedraagt (23), bedraagt de resulterende volumefractie van RBC’s in ons monster ongeveer 0,1. Als hiermee rekening wordt gehouden met behulp van vergelijking 12, zijn de voorspelde bezinkingssnelheden voor RBC’s in mediums 1 en 2 respectievelijk 307 micron/seconde en 62 micron/seconde. Bovendien bevatten bloedkweken op het moment dat zij positief worden ∼108 CFU (kolonievormende eenheden) (cellen) bacteriën per ml suspensie (24). Door hun geringe grootte (straal ∼1 micron) blijft hun volumefractie echter kleiner dan 0,001, en kan het “gehinderde bezinkingseffect” worden verwaarloosd.

Gegeven een monstervolume waaruit men wenst te isoleren de celtype (s) van belang, kan het stroomschema in de aanvullende materialen (Supplementary Figuur 1) worden gebruikt om de keuze van sedimentatiebuffer gids, voorspellen de sedimentatiesnelheden van de cellen van belang in de genoemde buffer, bepalen het juiste volume (kolom lengte in de beschikbare centrifugatie buis) worden gebruikt, en uiteindelijk bereken de optimale duur van centrifugatie (operationele venster) met behulp van de centrifuge (s) beschikbaar. Voor ons systeem (5 ml “positieve” bloedkweekbouillon in centrifugebuisjes van 15 ml) wordt het proces samengevat in tabel 1.

Tabel 1. Theoretische voorspellingen van de minimale kolomlengte en de minimale/maximale bedrijfstijd.

Experimentele validatie

We hebben eerst een synthetische “positieve bloedkweekbouillon” bereid door in 8 ml BACTEC Ped-Plus-medium (Becton Dickinson, Sparks, MD), 2 ml vers bloed (afgenomen van een vrijwilliger), en 0.1 ml van een suspensie met ∼104 CFU (cellen) per ml E. coli K-12 en incubeer het mengsel op een nutating mixer bij 37°C gedurende een nacht (12-14 uur) om een suspensie met ∼109 RBC’s/mL en 108 CFU/mL bacteriën te verkrijgen. 1,5 ml van de bouillon werd in een microcentrifugebuisje (Eppendorf, New York, USA) gedaan en de cellen werden door centrifugeren “gepelletiseerd”. Het supernatant werd afgetapt en de massa van 1 ml werd gemeten met behulp van een balans (OHaus® GA-110) om de dichtheid van de vloeistof in de bouillon te schatten.

Extra werd 5 ml van de positieve bloedkweekbouillon geladen bovenop 5 ml Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA). Meerdere van deze buisjes werden geladen in een Eppendorf-5804 bench-top centrifuge en gecentrifugeerd voor verschillende lengtes van de tijd (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min, en 90 min). Aan het einde van het centrifugeerproces werd het buisje voorzichtig verwijderd, waarbij de bovenste laag (bloedkweekbouillon) werd weggegooid, terwijl de Histopaque-laag werd verzameld zonder het sediment op de bodem (indien aanwezig) te verstoren. De concentratie bacteriën in de verzamelde vloeistof werd bepaald volgens standaardmethoden, waaronder seriële verdunning, uitplaten op Tryptische Soja Agar, incubatie en kolonietelling (25). Concentraties van RBC’s werden verkregen door onderzoek van een aliquot van het monster in een hemocytometer onder een microscoop (26).

Resultaten en discussie

Resultaten zijn samengevat in figuur 3. De lijnen geven het theoretische aantal bloedcellen of bacteriën verwacht aanwezig te zijn in de Histopaque laag (minus het sediment op de bodem) op basis van onze theoretische voorspellingen. De ononderbroken symbolen vertegenwoordigen het gemiddelde van ten minste drie metingen van de waargenomen aantallen RBC’s (vierkanten), en E. coli (ruiten). De foutbalkjes zijn de standaardafwijking.

Zoals te zien in figuur 3 komt het waargenomen gedrag kwalitatief overeen met onze voorspellingen; voor beide dichte deeltjes (RBC’s en bacteriën) nemen de concentraties in de Histopaque aanvankelijk toe met de tijd, blijven vervolgens gedurende een bepaalde tijd constant en nemen ten slotte af. Er werd echter vastgesteld dat voor de RBC’s het volledige proces (stijging, stationaire toestand en daling) iets trager verloopt dan voorspeld. Het effect van deze iets lagere sedimentatiesnelheid heeft gelukkig geen invloed op ons werkingsvenster, aangezien het begin van het venster wordt bepaald door de tijd die nodig is om alle bacteriën in de dichte buffer te krijgen. Tegen de tijd dat dat gebeurt, is de concentratie van RBC’s in de dichte buffer te verwaarlozen. Met andere woorden, het door onze modellen voorspelde werkingsvenster (∼20 min tot ∼75 min) blijkt te gelden.

De meeste algemeen voorkomende bacteriën zijn ook vrij klein (∼1 micron in karakteristieke lengte) en hun dichtheden zijn vergelijkbaar. (b.v. 1,1 g/mL voor Pseudomonas (27); 1,13 g/mL voor Streptococcus (28), en 1,135 g/mL voor Bacillus (29)). Zij hebben dus waarschijnlijk sedimentatiesnelheden die vergelijkbaar zijn met die van E. coli in zowel bloedkweekbouillon als Histopaque-1083, en bijgevolg zou het werkvenster ook vergelijkbaar moeten zijn. Hoewel onze operationele venster (∼20 min tot ∼75 min) is alleen van toepassing voor onze hardware en experimentele parameters, onze theoretische analyse biedt een basis voorspellen van andere operationele vensters, niet alleen voor het doel van het isoleren van bacteriën uit positieve bloedkweek bouillons met verschillende hardware, maar ook om andere doelcellen te isoleren uit verschillende matrices met behulp van dichte buffers. Deze methode kan ook sequentieel worden gebruikt om een target te isoleren uit een mengsel dat zowel sneller bezinkende als trager bezinkende soorten bevat. In dergelijke gevallen zou men gebruik maken van onze methode om eerst te elimineren alle sneller bewegende soorten, en vervolgens te gebruiken om de snelste afwikkeling soort doel in de resterende mengsel.