Mechanismen van resistentie tegen fluoroquinolonen en carbapenems bij Pseudomonas putida

Abstract

Doelstellingen: Pseudomonas putida is een weinig voorkomende opportunistische ziekteverwekker, die gewoonlijk gevoelig is voor antimicrobiële middelen. Gegevens over resistentie tegen antimicrobiële middelen in klinische P. putida-isolaten zijn beperkt.

Patiënten en methoden: Gevoeligheden voor fluoroquinolonen, carbapenems en andere antibiotica werden gekarakteriseerd in vijf klinische isolaten van P. putida die werden teruggevonden bij verschillende patiënten met urineweginfecties als oorzakelijke pathogenen. Resistentie tegen fluorochinolonen en carbapenem werd genetisch gekarakteriseerd met behulp van PCR en DNA-sequencing. Buitenste membraan proteïne (OMP) profielen werden gekarakteriseerd door SDS-PAGE.

Resultaten: Vier van de vijf isolaten waren resistent of intermediair tegen zowel fluoroquinolonen als carbapenems. Nucleotide-sequenties in de quinolonen-resistentiebepalende regio’s suggereerden dat aminozuurmutaties zoals Thr-83→Ile in GyrA en Glu-469→Asp in GyrB kunnen bijdragen aan hoge resistentie tegen fluorochinolonen. Vier metallo-β-lactamase-producerende isolaten die resistentie tegen carbapenems vertoonden, waren drager van de IMP-type metallo-β-lactamase-genen. Een gecombineerd effect van verminderde productie van 46 kDa OMP en metallo-β-lactamase productie werd aangetoond door een P. putida isolaat dat de hoogste MIC’s van carbapenems vertoonde.

Conclusies: Deze studie identificeerde mechanismen van resistentie tegen fluoroquinolonen en carbapenems in klinische P. putida-isolaten.

Inleiding

Pseudomonas putida, een niet-fermenterende Gram-negatieve bacil, is een opportunistische menselijke ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor bacteriëmie en sepsis bij neonatale, neutropene en kankerpatiënten, alsook voor urineweginfecties (UTI’s).1-4 Hoewel ongebruikelijk, kan P. putida een oorzaak zijn van nosocomiale infecties bij gecompromitteerde gastheren.3

De meeste P. putida zijn gevoelig voor antimicrobiële middelen zoals carbapenems, fluorochinolonen en aminoglycosiden.5-7 Er zijn echter klinische isolaten van P. putida gerapporteerd die metallo-β-lactamasen produceren die resistentie verlenen tegen β-lactamines, waaronder carbapenems.3,4,8,9 Voorts zijn onlangs metallo-β-lactamase-producerende isolaten gemeld die naast β-lactamines ook resistentie vertoonden tegen ciprofloxacine, gentamicine en tobramycine.3 Het opduiken van meervoudig resistente P. putida is een oorzaak geworden van problemen bij de behandeling van infecties en vormt een risico van nosocomiale overdracht.

In enkele eerdere studies is de antibioticaresistentie van P. putida gekarakteriseerd met betrekking tot de productie van metallo-β-lactamasen en kenmerken van effluxsystemen.3,4,8-12 Carbapenem-resistente P. putida produceren vaak IMP- en VIM-type metallo-β-lactamases volgens rapporten uit Europa, Korea en Japan.3,4,8,9,9a Efflux-systemen zoals TtgABC, MepABC, TtgDEF en ArpABC kunnen ook bijdragen tot multiple-drug resistentie in P. putida.10-12Pseudomonas aeruginosa heeft het vermogen om snel resistent te worden in de loop van een behandeling,13 hoewel onduidelijk is of P. putida hetzelfde potentieel heeft. Om het risico op het ontstaan van antibioticaresistentie in te schatten, zijn overvloedige gegevens betreffende resistentie tegen antimicrobiële middelen in klinische P. putida isolaten nodig. In deze studie bepaalden we de gevoeligheid voor antimicrobiële middelen, waaronder fluorochinolonen en carbapenems, en karakteriseerden we mechanismen van resistentie tegen fluorochinolonen en carbapenems, in klinische P. putida isolaten die gedurende een periode van 1 jaar in ons ziekenhuis werden teruggevonden als pathogenen die UTI’s veroorzaakten.

Patiënten en methoden

Patiënten

Vijf patiënten (vier mannen en een vrouw) gediagnosticeerd met acute, herhaalde of chronische UTI’s veroorzaakt door P. putida in het Academisch Ziekenhuis van Hamamatsu werden opgenomen in onze studie van oktober 2001 tot september 2002.

Bacteriestammen en microbiologische methoden

Stammen die in deze studie werden gebruikt, waren vijf klinische isolaten van P. putida die bij verschillende patiënten als oorzakelijke verwekker waren verkregen. Identificatie werd uitgevoerd door standaard biochemische testen in ons klinisch microbiologisch laboratorium. Alle isolaten werden verkregen uit urine. De SpeI-restricted fragmentpatronen van het chromosomale DNA van deze vijf isolaten varieerden (Figuur 1). Bacteriën werden bewaard bij -70°C in hartinfusiebouillon (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan) met 20% glycerol. Vervolgens werden de bacteriën geënt op hartinfusie-agarplaten (Nissui Pharmaceutical) en ’s nachts bij 37°C geïncubeerd. MIC’s werden bepaald met een agar-verdunningsmethode zoals beschreven door het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), voorheen het National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).14 Gevoeligheidsbepaling werd uitgevoerd met Mueller-Hinton agar (Nippon Becton Dickinson, Tokyo, Japan) in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. MIC-interpretatiecriteria voor ceftazidime, imipenem, meropenem, norfloxacine, levofloxacine, gatifloxacine, gentamicine, amikacine en minocycline volgden die van de CLSI/NCCLS.14 MIC-breekpunten van andere antimicrobiële stoffen werden niet gedefinieerd.

Antimicrobiële stoffen

Mplificatie en DNA-sequencing van quinolon-resistentiebepalende regio’s

Chromosomaal DNA werd uit P. putida-isolaten geëxtraheerd zoals eerder beschreven.15 PCR-amplificatie werd uitgevoerd met specifieke primersets. Een primerset van 5′-gacggcctgaagccggtgcac-3′ en 5′-gcccacggcgataccgctgga-3′ amplificeerde een fragment van 417 bp van de quinolon-resistentiebepalende regio’s (QRDR’s) van het gyrA-gen van positie 115 tot 531.16 Een primerset van 5′-agtacttcgccgacttcct-3′ en 5′-tacaggcgcgacaggcgctt-3′ amplificeerde een 739 bp fragment van de QRDR’s van het gyrB-gen van de posities 1073 tot 1811.17 Een primerset van 5′-tctacgccatgagcgaactgg-3′ en 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ amplificeerde een 262 bp fragment van de QRDR’s van het parC gen van posities 158 tot 419.18 Amplificaties werden uitgevoerd met Advantage-GC2 enzym (BD Biosciences Clontech Japan, Tokyo, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. De QRDR’s werden gesequeneerd met een BigDye terminator v3.0 Taq cycle sequencing ready reaction kit met AmpliTaq DNA polymerase (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) en een geautomatiseerd DNA-sequencing systeem (ABI PRISM 310 genetic analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Genetische detectie van metallo-β-lactamasegenen

Preparatie van buitenmembraaneiwitten

Buitenmembraaneiwitten (OMP’s) werden bereid zoals eerder beschreven.21 De monsters werden geanalyseerd met SDS-PAGE.

Resultaten

Voelbaarheid

De resultaten van de gevoeligheidstests voor fluoroquinolonen en carbapenems zijn samengevat in respectievelijk tabel 1 en tabel 2. MIC’s van β-lactammen varieerden van >128 mg/L voor ampicilline en cefaloridine, 2 tot >128 mg/L voor ceftazidime, 1 tot 128 mg/L voor imipenem, 0,5 tot >128 mg/L voor panipenem, 4 tot >128 mg/L voor meropenem en 1 tot >128 mg/L voor biapenem. De MIC-bereiken van aminoglycosiden en minocycline waren als volgt: 0,25 tot 8 mg/L voor gentamicine, 0,5 tot 8 mg/L voor amikacine, 0,5 tot 1 mg/L voor kanamycine en 4 tot 64 mg/L voor minocycline. Vier isolaten waren resistent of intermediair tegen zowel fluorochinolonen als carbapenems, terwijl één isolaat, HU2001-429, vatbaar was voor zowel β-lactamines als fluorochinolonen. Drie P. putida-isolaten, HU2001-412, HU2001-419 en HU2001-451, vertoonden resistentie tegen alle onderzochte β-lactamines, zoals ceftazidime, imipenem en meropenem. Drie isolaten, HU2001-412, HU2001-419 en HU2002-467, vertoonden een hoge resistentie tegen fluorochinolonen (>128 mg/l), waaronder norfloxacine, levofloxacine, sparfloxacine, gatifloxacine en pazufloxacine, en ook resistentie tegen minocycline (32 tot 64 mg/l). Bij de vijf isolaten lag het MIC-bereik voor sitafloxacine tussen ≤0,125 en 8 mg/L.

Fluoroquinolone-resistentie

Carbapenem-resistentie

Van de vijf P. putida-isolaten waren er vier die carbapenem-resistentie vertoonden en drager waren van het IMP-type metallo-β-lactamasegen, terwijl de VIM-type metallo-β-lactamasegenen niet door PCR werden gedetecteerd (tabel 2). MIC-bereiken van carbapenems bij P. putida die drager was van de IMP-type metallo-β-lactamase genen waren als volgt: 8 tot 128 mg/L voor imipenem, 32 tot >128 mg/L voor panipenem, 128 mg/L of meer voor meropenem en 32 tot >128 mg/L voor biapenem. Bij P. putida HU2001-451, die van de vijf isolaten de hoogste MIC’s voor carbapenems vertoonde, was de productie van 46 kDa OMP door SDS-PAGE niet aantoonbaar, terwijl die van P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 en HU2002-467 op soortgelijke wijze werden gedetecteerd (tabel 2).

Discussie

In deze studie karakteriseerden we gevoeligheden voor fluoroquinolonen en carbapenems in vijf klinische isolaten van P. putida geïsoleerd uit verschillende patiënten met acute, herhaalde of chronische UTI’s. Alle vijf isolaten toonden verschillende PFGE genotypes, wat suggereerde dat geen van de infecties veroorzaakt door deze P. putida nosocomiaal waren. Vier van de vijf isolaten waren resistent of intermediair tegen zowel fluoroquinolonen als carbapenems. Drie isolaten vertoonden hoge resistentie (>128 mg/L) tegen alle onderzochte fluoroquinolonen behalve sitafloxacine. Van de fluoroquinolonen die in deze studie werden onderzocht, vertoonde sitafloxacine een superieure werkzaamheid tegen de P. putida-isolaten. De isolaten die zeer resistent waren tegen fluoroquinolonen waren ook resistent tegen carbapenems en minocycline. Alle isolaten waren gevoelig voor aminoglycosiden zoals amikacine.

Er is weinig onderzoek gedaan naar de resistentie van P. putida tegen fluorochinolonen.6,12 Bij P. aeruginosa zijn aminozuurmutaties in DNA-gyrase of topoisomerase IV, veroorzaakt door mutaties in de QRDR’s van GyrA en ParC, de belangrijkste mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de resistentie tegen fluorochinolonen, terwijl sommige rapporten hebben gesuggereerd dat mutaties van GyrB betrokken zijn bij de resistentie tegen fluorochinolonen.18,22 Een secundair resistentiemechanisme in P. aeruginosa waarbij effluxsystemen betrokken zijn, draagt bij tot verminderde gevoeligheid voor fluorochinolonen.22,23 In deze studie werden aminozuurmutaties in de QRDR’s van GyrA, GyrB en ParC vergeleken tussen vijf klinische isolaten van P. putida. Fluoroquinolon-resistente P. putida had extra mutaties zoals Thr-83→Ile in GyrA en Glu-469→Asp in GyrB, die overeenkwamen met mutaties gevonden in fluoroquinolon-resistente P. aeruginosa.22,23 Deze resultaten wijzen erop dat aminozuurmutaties in de QRDR’s zoals Thr-83→Ile in GyrA en Glu-469→Asp in GyrB kunnen bijdragen tot hoge resistentie tegen fluorchinolonen, hoewel niet werd vastgesteld of transformatie door plasmiden met de wildtype gyrA-, gyrB- of parC-genen in dergelijke isolaten de MIC’s van fluorchinolonen zou verlagen.24 Het MIC-bereik van sitafloxacine lag voor de vijf P. putida-isolaten tussen ≤0,125 en 8 mg/L. Hoewel eerdere rapporten hebben aangetoond dat overexpressie van de TtgABC, MepABC, TtgDEF en ArpABC efflux systemen ook kan bijdragen aan multiple-drug resistentie in P. putida,10,11,12 bleef de rol van efflux systemen onduidelijk in deze studie.

Carbapenem resistentie in P. putida veroorzaakt door productie van metallo-β-lactamases is gerapporteerd.3,4,8,9,9a Deze in P. putida aangetroffen metallo-β-lactamasen omvatten IMP- en VIM-types.3,4,8,9,9a In de vier carbapenem-resistente P. putida werd de productie van metallo-β-lactamasen gedetecteerd met een disc-diffusiemethode (gegevens niet aangetoond). Deze isolaten waren drager van de IMP-type metallo-β-lactamase genen, terwijl de VIM-type metallo-β-lactamase genen niet door PCR werden gedetecteerd. De prevalentie van metallo-β-lactamase-producerende P. putida is een belangrijk klinisch probleem en vertegenwoordigt een reservoir van genetische determinanten van β-lactam resistentie. Andere belangrijke mechanismen van carbapenemresistentie bij P. aeruginosa zijn mutatie-immuniteit door verlies van OprD – een porinevormend transmembraankanaal dat toegankelijk is voor carbapenems maar niet voor andere β-lactamines – en de productie van metallo-β-lactamases.21,25,26 Verlies van OprD leidt tot resistentie tegen imipenem en verminderde gevoeligheid voor meropenem in P. aeruginosa.27 In P. putida HU2001-451, die de hoogste MIC’s (≥128 mg/L) van alle carbapenems vertoonde onder vier carbapenem-resistente isolaten, was de productie van 46 kDa OMP verlaagd in vergelijking met die van andere isolaten. De OMP-profielen van P. putida HU2001-451 waren vergelijkbaar met die van carbapenem-resistente P. aeruginosa, bij wie in onze eerdere studie een verminderde productie van OprD werd vastgesteld.21 Deze resultaten toonden een gecombineerd effect aan van verminderde productie van 46 kDa OMP naast de productie van metallo-β-lactamases op carbapenemresistentie in het isolaat, hoewel onduidelijk was of andere β-lactamases relevant waren voor carbapenemresistentie.

Concluderend hebben we fluorchinolon- en carbapenemresistentie gekarakteriseerd in klinische isolaten van P. putida. Onze resultaten wijzen erop dat aminozuurmutaties in de QRDR’s, zoals Thr-83→Ile in GyrA en Glu-469→Asp in GyrB, kunnen bijdragen aan hoge resistentie tegen fluoroquinolonen in P. putida. Vier metallo-β-lactamase-producerende P. putida-isolaten die resistentie tegen carbapenems vertoonden, waren drager van het IMP-type metallo-β-lactamasegen. We vonden een gecombineerd effect van verminderde productie van 46 kDa OMP en productie van metallo-β-lactamases die carbapenem-resistentie versterkten in een isolaat van P. putida met de hoogste MIC’s van carbapenems.

We danken Miroku Medical Laboratory, Saku, Nagano, Japan, voor PFGE-analyse. T. H. wordt ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research (17790353) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan.

Auteursopmerkingen

1Department of Laboratory Medicine, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 2Group of Infection Control Research, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 3Division of Pharmacy, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 4Department of Clinical Laboratory Medicine, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 54 Shogoin-Kawahara-cho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8507, Japan