Instrument and reagents
Het instrument voor MTX detectie was Siemens VIVA-E die parametrisatie mogelijk maakt door de beschikbaarheid van open kanaal. MTX-reagentia en kalibratoren werden gekocht van Siemens (6L119UL).
Drie niveaus van kwaliteitscontrole (QC) materiaal werden gekocht van Bio-Rad (Irvine, CA), een extra aangepaste QC materiaal op 0,05 umol / L van Aladdin (Shanghai, China).
MTX methode vergelijking werd uitgevoerd door het analyseren van dezelfde monsters met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) assay (LC-20 AD vloeistofchromatografie, en AB SCIEX QTRAP®4500 Massaspectrometers).
Specimens
De testmonsters werden verkregen van de hematologische afdeling van Dalian kinderziekenhuis. Sommige geteste monsters en MTX-vrije icterische plasmamonsters werden verzameld voor het bestuderen van triglyceride en bilirubine-interferentie. Er werd niet ingegrepen in de behandeling van de patiënten, en geen van de individuele informatie van de patiënt werd vermeld.
Reagentenbereiding
De Siemens Reagent Kit bevat Antilichaam/Substraat Reagens A, Enzym Reagens B, Emit Drug Assay Buffer Concentraat, en Emit Methotrexaat Kalibratoren. Reagens A en B werden gereconstitueerd met 3,0 ml gedeïoniseerd water, gemengd door zachtjes te zwenken, en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geëquilibreerd. MTX-bufferconcentraat werd gemengd met gedeïoniseerd water (1:15 v/v). Werkoplossing van reagens A en B werd bereid door verdunning van stockoplossingen 1:9 v/v met bufferoplossing.
Enkele ijkstoffen (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/L) werden gereconstitueerd tot de aangegeven concentratie met 1.0 mL gedeïoniseerd water volgens de aanwijzingen van de fabrikant, andere kalibratoren 1,50 en 2,00 μmol/L werden gereconstitueerd tot 1,00 μmol/L met respectievelijk 1,50 en 2,00 mL gedeïoniseerd water. Vervolgens werd de 0,20 μmol/L kalibrator verdund tot 0,05 μmol/L, en de 1,00 μmol/L werd verdund tot 0,10 en 0,25 μmol/L. De nieuwe set van kalibratoren (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 en 1,00 umol / L) voldoen aan de eisen van de gewijzigde kalibrator curve.
Programmering van de Viva-E instrument
Een open kanaal op de Viva-E werd geprogrammeerd om volumes van reagentia A & B veranderen van 180 pi naar 110 pi (110 pi is de ondergrens van de Viva-E voor MTX-reagentia). Er werd een zespuntskalibratiecurve geprogrammeerd met gemodificeerde kubische spline regressie. De zes door de kit geleverde kalibratiemiddelen waren 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 en 2,00 μmol/L. Wanneer de volumes van reagentia A en B werden verlaagd, waren zij niet voldoende om te reageren met monsters van meer dan 1 μmol/L. Bijgevolg werd de nieuwe kalibratorreeks van de gewijzigde EMIT-test gewijzigd in 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L binnen een bereik van 0,05 tot 1,00 μmol/L.
Volgens de instructie van de commerciële kit moeten de monsters met een concentratie van meer dan 1,00 μmol/L worden verdund in het bereik van de kalibratiecurve (0.05-1,00 μmol/L) met een verdunningsfactor van 10, 100 of 1000.
Limit of blank, limit of detection, limit of quantitation
Limit of blank (LOB), limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ) werden bepaald volgens CLSI EP17-A . De LOB werd bepaald aan de hand van zes monsters (S1-S6, 10 herhalingen gedurende 10 dagen): S1 en S2 waren nulkalibratoren van twee verschillende kalibratorpartijen, S3 en S4 waren verdunningsmiddel, S5 en S6 waren blanco plasma. De LOD werd bepaald met 5 poules van laagwaardige monsters, variërend van de LOB tot viermaal de LOB (12 replicaties gedurende 12 dagen). LOB en LOD werden bepaald met twee partijen reagentia. Volgens de klinische eisen werd het doel voor de totale fout op 20% gesteld. De testresultaten van het LOD-onderzoek werden gebruikt om de bias en imprecisie voor elk gehalte van de analyt te schatten. Vervolgens werden deze gegevens gecombineerd om de totale fout op elk niveau te schatten en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) te bepalen.
Intra-dag en inter-dag imprecisie
Intra-dag (n = 10) imprecisie van gemodificeerde assay werd geëvalueerd door één niveau van controlematerialen (0,05 μmol/L) en drie niveaus van patiëntenmonsters (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L). Op elk niveau werden 10 replicaten uitgevoerd. Inter-dag (n = 25) imprecisie werd getest op deze 4 niveaus in 5 opeenvolgende dagen, en 5 replicaten voor elk niveau. Alle monsters waren afkomstig van verschillende patiënten. De gemeten resultaten werden uitgezet tegen de verwachte waarden.
Lineariteit
De lineariteit werd geverifieerd door de kwaliteitscontrole van 2,00 μmol/L (hc) te verdunnen met buffer (c0) in de volgende verhoudingen: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Elke verdunning werd driemaal geanalyseerd, de lineariteitsvergelijking van de gewijzigde assay werd berekend op basis van de gemiddelden van de gemeten resultaten en de verwachte waarden.
De LC-MS/MS-assayprocedure
De LC-MS/MS-assay die in deze studie werd uitgevoerd, is als volgt. Als interne standaard werd difenhydramine gebruikt. Acetonitril werd gebruikt als serumprecipitans om albumine te elimineren. Voor LC-scheidingen werd een Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm) kolom gebruikt. De mobiele fase was 0,1% mierenzuur en acetonitril. Gradient-elutie werd uitgevoerd met een debiet van 0,5 ml/min bij 30 °C. De meervoudige reactie monitoring (MRM) modus werd gebruikt om MTX en difenhydramine te detecteren in electrospray ionisatie (ESI) bron en positieve ionenscan modus. MTX werd gedetecteerd bij m/z 455.0 → 308.1, difenhydramine werd gedetecteerd bij m/z 256.0 → 167.0 .
Methodevergelijking
Negenzeventig monsters werden verzameld van acute lymfoblastische leukemiepatiënten in de hematologische afdeling van het Dalian Children’s ziekenhuis. Elk monster werd getest met respectievelijk de gemodificeerde EMIT-test en de LC-MS/MS-test. De resultaten werden vergeleken met behulp van eenvoudige lineaire regressieanalyse (MedCalc Statistical Software versie 15.6.1). Nog eens 45 monsters werden getest met behulp van gemodificeerde EMIT-assay en commerciële EMIT-assay voor methodevergelijking.
Interferentiestudies
Triglycerideninterferentie werd beoordeeld door monsters te bereiden met Intralipid (20% IV vetemulsie). De concentratie van triglyceriden in de monsters was 1000 ng/dL. Daarna werd de gepaarde-T-test uitgevoerd.
Bilirubine-interferentie werd gesimuleerd met enkele MTX-vrije icterische plasmamonsters met een bilirubineconcentratie van niet minder dan 30 mg/dL.
De interferentie van de structureel verwante metaboliet 7-hydroxy-methotrexaat werd beoordeeld door verschillende niveaus van 7-hydroxy-methotrexaat aan de plasmamonsters toe te voegen, de concentratie van MTX in die monsters was 0,05 μmoL/L. En de testresultaten van de huidige monsters werden vergeleken met de resultaten van de oorspronkelijke monsters .