RNase A: Frequently Asked Questions | AG Scientific Blog

Inleiding tot RNase

Ribonucleasen (RNasen) zijn een grote groep hydrolytische enzymen die ribonucleïnezuurmoleculen (RNA) afbreken. Het zijn nucleasen die de afbraak van RNA in kleinere componenten katalyseren. Zij vormen een superfamilie van enzymen die de afbraak van RNA katalyseren en werkzaam zijn op het niveau van transcriptie en translatie.

3D-conformatie van ribonuclease A enzym

Deze enzymen zijn aanwezig in alle levende cellen en biologische vloeistoffen, met inbegrip van prokaryoten en eukaryoten, en vervullen vele belangrijke functies. RNasen zijn alomtegenwoordig, met een zeer korte levensduur in een onbeschermde omgeving. De cytotoxische effecten omvatten RNA-splitsing die leidt tot de remming van de eiwitsynthese en de inductie van apoptose. Deze cytotoxische effecten kunnen worden teweeggebracht door RNase op het buitenoppervlak van de cel aan te brengen, maar men heeft ontdekt dat de cytotoxiciteit 1000-voudig toeneemt wanneer het enzym kunstmatig in het cytosol wordt gebracht, hetgeen erop wijst dat internalisering in de cel de snelheidsbeperkende stap voor de toxiciteit is.

RNasen worden ingedeeld in endoribonucleasen en exoribonucleasen. Endoribonucleasen zijn de vormen A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM, en V.

Exoribonucleasen omvatten RNase-vormen PH, II, R, D, en T, alsmede polynucleotidefosforylase (PNPase), oligoribonuclease, exoribonuclease I en exoribonuclease II. Deze enzymen splitsen verschillende RNA-soorten.

De laatste tijd hebben onderzoekers aandacht besteed aan RNases als mogelijke middelen voor de behandeling van kanker. Het idee is om een enzym te vinden dat selectief kankercellen beschadigt zonder de omliggende normale cellen aan te tasten.

RNase A producten van AG Scientific, Inc.

Veelgestelde vragen over RNase A

Wat is RNase A?

Ribonuclease A is een spijsverteringsenzym dat wordt afgescheiden door de alvleesklier en dat specifiek RNA (maar geen DNA) polymeren “verteert” of hydrolyseert door endonuclease splitsing van de fosfodiester bindingen die de covalente verbindingen vormen tussen aangrenzende ribonucleotide residuen in deze moleculen.

Waar staat “A” voor in RNase A?

De “A” in zijn naam verwijst niet naar zijn substraatspecificiteit, maar naar de overheersende vorm van het enzym, geproduceerd door de alvleesklier van runderen. RNase A is ongemodificeerd, terwijl RNase B, RNase C, en RNase D mengsels van glycovormen zijn.

Omdat RNase A in grote hoeveelheden en hoge zuiverheid beschikbaar is, is het het voorwerp geweest van baanbrekend werk in de eiwitchemie en de enzymologie. Bovendien hebben cytotoxische varianten en homologen van het enzym hun nut bewezen als chemotherapeutische middelen.

Wat is de geschiedenis van dit enzym?

Het werd gebruikt door Christian Anfinsen om aan te tonen dat de volgorde van aminozuren, de structuur van een gevouwen eiwit bepaalt en het werd gebruikt door Stanford Moore en William Stein om aan te tonen dat een specifieke rangschikking van aminozuren wordt gebruikt in het katalytische centrum van enzymen.

Ribonuclease A was ook het eerste enzym dat door R. Bruce Merrifield werd gesynthetiseerd, waarmee hij aantoonde dat biologische moleculen gewoon chemische entiteiten zijn die kunstmatig kunnen worden geconstrueerd. Al deze centrale concepten, ontdekt met behulp van ribonuclease, werden bekroond met Nobelprijzen.

Wat is de structuur van RNase A?

RNase structuur

De relatief kleine, 124 aminozuursequentie van RNase A dat een molecuulmassa heeft van 12.600 Da. bevat vier His-residuen, waarvan twee residuen His12 en His119 direct betrokken zijn als katalytische residuen van dit enzym. De imidazoolring van His12 heeft een anoniem lage pK-waarde (pK < 6,0), wat suggereert dat deze voor katalyse moet worden gedeprotoneerd. Omgekeerd heeft de imidazoolring van His119 een anoniem hoge pK-waarde (pK > 6,0), wat suggereert dat deze moet worden geprotoneerd voor katalyse.

Is Ribonuclease A een eiwit?

RNase A is een klein eiwit, het rijpe enzym heeft slechts 124 aminozuurresiduen, waaraan geen koolhydraten zijn verbonden. In tegenstelling tot andere enzymen bevat RNase A 19 van de 20 zuren, waarbij alleen tryptofaan ontbreekt.

Wat is het werkingsmechanisme?

His12 fungeert als een algemene base, die het 2′-OH proton van de sessiele ribonucleïne suikerring accepteert. Dit bevordert een nucleofiele aanval door de 2′-O op het meer positief geladen fosforatoom (P), waardoor een 2′-,3′-cyclisch ribonucleotide-fosfaattussenproduct ontstaat. De vorming van dit tussenproduct wordt vergemakkelijkt door de imidazool van His119 die fungeert als een algemeen zuur, door zijn proton af te staan aan het zuurstofatoom in de vatbare P-O-R’ binding.

Voor de tweede stap van de reactie worden de algemene zure en basische activiteiten van de zijketens van deze twee His-residu’s omgedraaid. His12 fungeert als een algemeen zuur, dat zijn nieuw verworven proton afstaat aan het 2′-,3′-cyclische ribonucleotidefosfaattussenproduct, terwijl His119 als een algemene base fungeert, dat een proton uit water accepteert om de hydroxylaanval op hetzelfde 2′-,3′-cyclische tussenproduct te bevorderen.

Wat is de splitsingsplaats van RNase A?

RNase A hydrolyseert efficiënt RNA-verontreinigingen in DNA-preparaten door het splitsen van de fosfodiester-binding tussen de 3′-fosfaatgroep van een pyrimidine nucleotide (C en U) en de 5′-ribose van zijn aangrenzende nucleotide 1, 2, 3. Het ontstane intermediaire 2′-,3′–cyclische fosfodiester wordt vervolgens verder gehydrolyseerd tot een 3′-monofosfaatgroep. Bovine pancreatic RNase A is een zeer stabiel eiwit van 124 aminozuren met de hoogst gemeten activiteit ten opzichte van enkelstrengs RNA en een twee maal zo snelle splitsingssnelheid bij cytidineresiduen in vergelijking met uridylresiduen.

Wat is de zuur/base katalyse reactie van RNase A?

RNase A gebruikt ook zuur/base katalyse om zijn substraten chemisch te veranderen. Zure of basische residuen van het enzym dragen protonen over aan of van het reagens om de zich ontwikkelende ladingen in de overgangstoestand te stabiliseren. De overdracht van protonen creëert gewoonlijk betere vertrekkende groepen, waardoor de reactie energetisch gunstiger wordt.

Histidine is een veel voorkomend aminozuurresidu dat betrokken is bij de katalyse, aangezien histidine een pKa-waarde heeft die dicht bij neutraal ligt, (pKa=6); daarom kan histidine zowel protonen accepteren als afstaan bij fysiologische pH.

Wat is de stabiliteit van Ribonuclease A?

Ribonuclease A is verbazingwekkend stabiel. Bijvoorbeeld, in een procedure voor het zuiveren van ribonuclease A uit alvleesklieren van koeien, worden extracten behandeld met zwavelzuur en dan bijna tot het kookpunt verhit, en ribonuclease A is het enige dat overleeft. Dit is niet verwonderlijk, aangezien het door de pancreas wordt afgescheiden en zijn werk moet doen in de onherbergzame omgeving van het spijsverteringskanaal. De stabiliteit van ribonuclease A is voor een groot deel te danken aan vier disulfidebruggen die verschillende delen van de keten aan elkaar lijmen.

Om de stabiliteit te behouden, moet het product in het algemeen worden opgeslagen en gehanteerd volgens de instructies van de leverancier.

Hoe wordt RNase A geïnactiveerd?

RNase A is een vrij stabiel enzym en bevat 4 disulfidebruggen, die voorkomen in alle pancreatische ribonucleases van zoogdieren. Wanneer de bruggen reductief worden verbroken, wordt het eiwit gedenatureerd en wordt het inactief. Bij reoxidatie plooit het eiwit zich opnieuw en wordt de activiteit volledig hersteld. Het is echter mogelijk de bruggen slechts gedeeltelijk te reduceren en de enzymactiviteit te behouden. Verwijdering van 4 peptiden aan de carboxyl terminus vernietigt de enzymactiviteit.

Wat remt RNase A?

Uridine vanadaat is een krachtige competitieve remmer van RNase A. Wat het zo krachtig maakt, is het feit dat de structuur ervan een overgangstoestand nabootst die in de reactie intermediair is.

Hoe wordt RNase A uit voorraad bereid?

RNase A wordt meestal bereid door de voorraad 10 minuten te koken om de verontreinigende DNase-activiteit te elimineren zonder de RNase aan te tasten. Verhitting tot 65°C heeft geen effect op RNase.

Hoe de bereide voorraad RNase A te reconstitueren?

RNase A kan worden opgelost in een concentratie van 1 tot 10 mg/ml in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, gedurende 15 minuten tot 100°C worden verhit om verontreinigende DNasen te inactiveren en langzaam tot kamertemperatuur worden afgekoeld en in aliquots worden gedoseerd.

Wat is de werkconcentratie van dit enzym?

Aanbevolen werkconcentratie van RNase A is 1 tot 100 µg/mL, afhankelijk van de toepassing. Het enzym is actief onder een breed scala van reactieomstandigheden. Bij lage zoutconcentraties (0 tot 100 mM NaCl) klieft RNase A enkelstrengs en dubbelstrengs RNA alsmede RNA-strengen in RNA-DNA-hybriden.

Wat is de opslagtemperatuur en hoe moet ik met dit product omgaan?

Bewaren in een goed afgesloten flacon bij -20ºC. Eenmaal geopend, dehydrateren boven silicagel onder vacuüm alvorens terug te brengen naar -20ºC. Wees voorzichtig bij het hanteren. Gebruik deze verbinding niet als u niet volledig opgeleid bent of niet op de hoogte bent van de gevaren.

Wat zijn de toepassingen van RNase A?

RNasen spelen een belangrijke rol bij de afbraak en omzet van RNA in alle organismen. Ribonuclease-enzym kan de RNA-helix afwikkelen door complexvorming met enkelstrengs RNA.

RNase A is een endoribonuclease met functies in het RNA-metabolisme en de regulering van genexpressie.

RNase A blijkt een belangrijke rol te spelen bij ziekten zoals auto-immuunziekten, nierinsufficiëntie en pancreasaandoeningen. Meer recent werd ook een anti-tumor activiteit gerapporteerd voor een RNase A met cytotoxische en cytostatische eigenschappen. De leden van de RNase A superfamilie komen op grote schaal tot expressie en zijn aanwezig in serum en weefsels van zoogdieren.

Het enzym kan worden gebruikt om RNA uit eiwitmonsters te hydrolyseren. Het is geschikt voor gebruik in RNase protection assays, om aspecifiek gebonden RNA te verwijderen, in de analyse van RNA-sequenties, om RNA in eiwitmonsters te hydrolyseren, en in de DNA-zuivering.

Wat is de verschijningsvorm/vorm van dit product?

Geleverd als een wit, chromatografisch gezuiverd, zoutvrij, gevriesdroogd poeder. Uiterlijk/vorm van het product kan variëren, afhankelijk van de fabrikant.

Aanvullende lezing

• Bronnen van DNA-verontreiniging in het Laboratorium
• Guanidine Thiocyanaat in RNA Lysis Buffers
• 8 Voordelen van het kiezen van AGS als uw Proteinase K leverancier