SNP-ChIP: a versatile and tag-free method to quantify changes in protein binding across the genome

Experimentele grondgedachte van SNP-ChIP

Het uitgangspunt van SNP-ChIP is dat cellen van dezelfde soort kunnen dienen als spike-in materiaal op voorwaarde dat ze voldoende genetische diversiteit herbergen, voornamelijk in de vorm van single-nucleotide polymorfismen (SNPs). Het signaal op elk polymorfisme biedt een onafhankelijke maat voor de verhouding test-monster / spike-in die samen de berekening van een normalisatiefactor en de juiste schaling van ChIP-seq resultaten mogelijk maakt (Fig. 1a). Als er voldoende genetische diversiteit om een grote fractie van sequencing leest worden toegewezen aan de genomen van oorsprong toe te staan, SNP-ChIP maakt het bovendien mogelijk het genereren van genoom-brede doel distributie profielen. Belangrijk is dat, omdat SNP-ChIP dezelfde soort gebruikt als de bron van het spike-in-materiaal, het zal werken met vrijwel elk doelwit in het proteoom van het organisme, met inbegrip van post-translationele modificaties, op voorwaarde dat een antilichaam van ChIP-kwaliteit beschikbaar is.

SNP-ChIP voegt de mogelijkheid toe om semi-kwantitatieve hoeveelheden doeleiwit te meten aan traditionele ChIP-seq. a De belangrijkste stappen van SNP-ChIP, geïllustreerd voor twee hypothetische condities. b Niveaus van het doeleiwit Red1, geproduceerd door SNP-ChIP (equivalent aan de genormaliseerde spike-in-normalisatiefactor van het wilde type), vergeleken met eerder gepubliceerde niveaus, gemeten met behulp van Western blot (gemiddelde +/- S.E.M.). Punten vertegenwoordigen individuele SNP-ChIP-afgeleide repliceren waarden en bars vertegenwoordigen gemiddelde waarde. c Fragment pileup geproduceerd met behulp van MACS2 met SPMR (fragment pileup per miljoen leest) sequencing diepte normalisatie van een voorbeeld chromosoom en chromosomale regio voor (bovenste paneel) en na (onderste paneel) spike-in normalisatie. d Doeleiwit Red1 niveaus voor Red1 dosering stam serie vergeleken met eerder gepubliceerde niveaus gemeten door Western blot (gemiddelde + / – S.E.M.) , zoals in (b)

SNP-ChIP van een snel evoluerende chromosomale eiwit

Om het nut van intra-species spike-ins te testen, wendden we ons tot chromatine-analyses in gist. We hebben ons specifiek gericht op chromosomen in meiose, omdat dit proces gaat veel breed verspreid chromosomale eiwitten en post-translationele modificaties. Een typisch voorbeeld is het axiale-element eiwit Red1, dat een belangrijke rol speelt in meiotische recombinatie. Red1 is breed gebonden langs chromosomen, maar net als andere meiotische factoren is zijn sequentie zelfs in nauw verwante soorten gedivergeerd. Bovendien kan Red1, net als veel andere eiwitten, niet gemakkelijk worden gemerkt zonder de eiwitfunctie te verstoren. Deze eigenschappen betekenen dat Red1 niet geschikt is voor standaard spike-in benaderingen, waardoor het een bijzonder geschikt doelwit is voor SNP-ChIP. Bovendien zijn mutaties die de algemene niveaus en chromosomale distributie van Red1 veranderen beschikbaar , het verstrekken van benchmarks voor het evalueren van de werkzaamheid van SNP-ChIP.

SNP-ChIP van Red1 werd uitgevoerd met behulp van de SK1 genetische achtergrond als teststam en een meiose-geoptimaliseerde variant van de veelgebruikte S288c referentiestam als spike-in . Voor beide genetische achtergronden zijn end-to-end genoomassemblages van hoge kwaliteit beschikbaar. Deze assemblages verschillen door ongeveer 76.000 SNP’s, verdeeld over een totale mediane afstand van 70 bp (Additional file 1: figuur S1a) consequent over alle chromosomen (Additional file 1: figuur S1b), die genoeg variatie om ondubbelzinnige toewijzing van een groot deel van de sequencing leest vormt. Voor het uitvoeren van SNP-ChIP, werden testcellen (SK1) gemengd met een constante fractie van meiotische spike-in cellen (S288c) voor het onderwerpen van de mengsels aan een standaard ChIP-seq protocol. De gegenereerde gelezen werden uitgelijnd met een hybride genoom gebouwd door concatenating genoom assemblages van de test en spike-in genomen. Leest werden uitgelijnd met perfecte match voorwaarden, met uitsluiting van alle leest uitlijnen op meer dan een locatie. Bijgevolg werden alle lezingen die ten minste één SNP overlappen toegewezen aan een specifiek genoom en genomische locatie, terwijl lezingen die een polymorfisme niet overlappen in kaart gebracht aan beide genomen en werden dus verwijderd.

We onderzochten aanvankelijk het vermogen van SNP-ChIP om veranderingen in chromatine associatie als gevolg van verminderde eiwitproductie te detecteren. Het red1ycs4S allel wordt veroorzaakt door een mutatie in de promotor van RED1 die leidt tot een vermindering van Red1 niveaus tot ongeveer 20-25% van het wildtype en een bijna volledig verlies van cytologisch waarneembare axiale elementen. Belangrijk is dat traditionele ChIP-seq analyse niet in staat was om deze verandering in eiwit abundantie te detecteren en geen onderscheidbare Red1 profielen opleverde tussen wild type en red1ycs4S mutanten. Wanneer we daarentegen SNP-ChIP toepasten om deze twee stammen te vergelijken, waren de verminderde Red1 bindingsniveaus duidelijk zichtbaar (Fig. 1b). Berekening van een spike-in normalisatiefactor op basis van de relatieve overvloed van het totale monster en spike-in leest leverde een Red1 niveau in de red1ycs4S mutant van 28,8 ± 5,1% (S.D.) van het wilde type, nauw overeenkomt met de gerapporteerde verandering in Red1 niveaus verkregen uit westerse analyse. Deze normalisatiefactor maakte een passende signaalschaling van ChIP-seq profielen voor de twee condities mogelijk (Fig. 1c).

SNP-ChIP werd verder gevalideerd door het toe te passen op een Red1 doseringsreeks, die bestaat uit verschillende combinaties van RED1 allelen (RED1, red1ycs4S, red1Δ) die een stapsgewijze afname van Red1 niveaus oplevert (Fig. 1d) . SNP-ChIP metingen van Red1 chromatine associatie in deze serie kwamen weer sterk overeen met eerder gepubliceerde eiwitniveaus (Fig. 1d). In feite, SNP-ChIP metingen bleken nauwkeuriger dan kwantitatieve westerse analyse, die niet in geslaagd om de verwachte vermindering van eiwitniveaus tussen RED1 / red1ycs4S en RED1 / red1Δ cellen op te lossen. Al met al tonen deze gegevens aan dat SNP-ChIP nauwkeurig reducties in globale Red1-binding meet over een breed scala van doeleiwitniveaus.

SNP-ChIP is robuust voor variatie in sequencing diepte en fractie van spike-in cellen

We gebruikten verschillende benaderingen om de technische robuustheid van SNP-ChIP te peilen. High-throughput sequencing technologieën produceren variabele aantallen leest per monster, afhankelijk van factoren zoals sequencing instrument en monster mutiplexing. Om het effect van lagere sequencing diepte op de reproduceerbaarheid van SNP-ChIP analyse te modelleren, hebben we de gelezen van de geïmmunoprecipiteerde en input monsters van wild type en red1ycs4S testcondities gesubsampled tot verschillende dieptes (variërend van 1 tot 10 miljoen gelezen). Uitzetten van subsample grootte tegen het aantal uitgelijnde leest toonde een perfect lineaire correlatie voor alle monsters (Fig. 2a), wat aangeeft dat een breed scala van sequencing diepte zal robuuste kwantitatieve informatie opleveren door SNP-ChIP. Voor deze bijzondere testomstandigheden, de fractie van de gelezen in kaart brengen van een specifiek genoom, en dus bewaard in de analyse, was ongeveer 20% voor het wilde type en 30% voor de red1ycs4S. We berekenden de spike-in normalisatiefactor met behulp van alle 10.000 mogelijke combinaties van gelezen submonsters (10 gelezen submonsters variërend van 1 tot 10 miljoen leest voor elk van de vier gesequenced monsters: wild type ChIP en input monsters plus red1ycs4S ChIP en input monsters) en vond een zeer strakke verdeling van de resultaten (0,2848 ± 0,0015, S.D.; Fig. 2b). Dit stelt vast dat sequencing diepte niet hoeft te worden uitgebalanceerd tussen geïmmunoprecipiteerd en input monsters, of tussen verschillende voorwaarden, om nauwkeurige verhoudingen van leest in kaart brengen om de test en de spike-in genomen te produceren.

SNP-ChIP is robuust voor variatie in zowel sequencing diepte en de hoeveelheid spike-in cellen. a Aantal uitgelijnde leest in SNP-ChIP als functie van de totale grootte van ruwe gelezen monster. Systematische ruwe gelezen subsamples van grootte 1 tot 10 miljoen werden verkregen voor elk monster en in kaart gebracht op de hybride SK1-S288c genoom. b Verdeling van spike-in normalisatiefactoren berekend met behulp van alle 10.000 mogelijke combinaties van gelezen subsamples in (a). De inzet is een zoom-in op een smal venster van de x-as waar alle waarden zich bevinden. c Percentage van de gelezen uitlijning met de spike-in genoom in de input monster versus de geïmmunoprecipiteerd monster (ChIP) voor wild type en red1-pG162A stammen. Opmerking: In tegenstelling tot red1ycs4S, die een introgressed regio met tientallen SNP rond de RED1 locus bevat, draagt de red1-pG162A mutant alleen de oorzakelijke promotormutatie. d Resulterende wild-type genormaliseerde spike-in factor (equivalent aan Red1 hoeveelheid) in de red1-pG162A stam na het uitvoeren van SNP-ChIP met percentages toegevoegde spike-in cellen variërend van 5 tot 30%. De resultaten suggereren dat spike-in materiaal proporties van 15% en hoger geschikt zijn voor SNP-ChIP

Een andere voorwaarde die van invloed kan zijn op de resultaten van SNP-ChIP is de hoeveelheid spike-in materiaal toegevoegd aan de monsters. Spike-in normalisatiemethoden gaan uit van een lineair verband tussen de hoeveelheid spike-in materiaal en het resulterende aandeel spike-in leest in het geïmmunoprecipiteerde monster. Deze voorwaarde is essentieel voor de resultaten om onafhankelijk te zijn van de hoeveelheid spike-in materiaal. Om deze aanname te verifiëren, hebben we monsters geprepareerd met een spike-in cel verhouding variërend van 5 tot 30%. Als testmonsters gebruikten we wild type en een stam met een enkele red1-pG162A promotormutatie die het red1ycs4S allel fenocopieert. Terwijl red1ycs4S een geïntegradeerde genomische regio bevat met tientallen SNPs rond de RED1 locus, werd de red1-pG162A mutant ontworpen om alleen de specifieke mutatie te dragen die verantwoordelijk is voor de reductie in Red1 niveaus. Zoals getoond in Fig. 2c, correleert de proportie van spike-in leest in de input monsters (die de hoeveelheid spike-in materiaal toegevoegd aan het test monster weergeeft) lineair met de resulterende proportie van spike-in leest in het geïmmunoprecipiteerde monster, voor zowel het wild type als het red1-pG162A monster. Bovendien is de red1-pG162A monster leverde een zeer vergelijkbaar Red1 hoeveelheid aan de red1ycs4S allel (28,8% versus 28,1% van het wilde type, respectievelijk, bij gebruik van 20% van de spike-in cellen), verdere ondersteuning van de robuustheid van de methode. Lage spike-in cel percentages (5 en 10%) resulteerde in iets hogere schattingen van de Red1 hoeveelheid (Fig. 2d), waarschijnlijk als gevolg van meer ruis. Deze resultaten suggereren dat spike-in materiaal proporties van 15% en hoger geschikt zijn voor SNP-ChIP. Alle andere hier getoonde experimenten gebruikten een spike-in verhouding van 20%.

Ten slotte onderzochten we de impact van de berekeningsmethode voor het berekenen van de spike-in normalisatiefactor. De SNP-ChIP normalisatiefactor berekend in de tot nu toe getoonde voorbeelden is gebaseerd op het totaal aantal gelezen uitgelijnd met de test en de spike-in genomen. Een alternatieve methode is het berekenen van de scalaire gemiddelde waarde van de uitgelijnde read pileup score. Wij hebben de bruikbaarheid van dit alternatief getest door de pileup score te berekenen op (1) alle genomische posities, (2) alleen op SNP posities, of (3) op SNP posities die binnen zogenaamde signaalpieken vallen (zie sectie Methoden). De laatste aanpak sluit effectief regio’s uit waarvan verwacht wordt dat ze alleen achtergrondsignaal bevatten, samen met eventuele vals-negatieve regio’s. We vonden zeer vergelijkbare waarden en een hoge concordantie tussen alle vier de methoden in alle gevallen (Additional file 2: figuur S2a), hoewel lezen pileups consequent iets lagere waarden produceren dan de read count methode (Additional file 2: figuur S2b). Over het algemeen is het verschil echter relatief klein en wij geloven dat de read count-gebaseerde methode, die rekenkundig veel eenvoudiger is, een geschikte benadering vertegenwoordigt, althans voor breed gedistribueerde eiwitten.

Binding profielen rechtstreeks verkregen uit SNP-ChIP experimenten

Het primaire nut van SNP-ChIP is het genereren van een normalisatiefactor die het mogelijk maakt schalen van profielen verkregen door traditionele ChIP-seq experimenten uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden (Fig. 1c). Gezien de brede distributie van SNPs over de twee geanalyseerde genomen, onderzochten we de mogelijkheid dat SNP-ChIP ook direct informatieve bindingsprofielen zou kunnen opleveren, hoewel deze toepassing duidelijk beperkt wordt door de beschikbare SNP-dichtheid. Het vergelijken van een monster gesequenced met spike-in om gegevens verkregen met behulp van een replicaat, niet-gespiked monster blijkt dat signaal sporen van gespiked monsters nauw weerspiegelen die van de niet-gespiked controle, hoewel sommige signaal hiaten kan worden gezien in de gespiked monster (Additional file 3: figuur S3a; voorbeelden aangegeven door de rode pijlen). Dus, zoals verwacht, het gebruik van dezelfde soort spike-in veroorzaakt enig verlies van informatie. Dit probleem lijkt verwaarloosbaar voor brede pieken, aangezien de genoemde pieken een zeer nauwe overeenkomst vertonen (Additional file 3: figuur S3b). Smalle pieken vertonen meer onenigheid, met slechts ongeveer een derde van de opgeroepen pieken die tussen de twee monsters overlappen. Deze gegevens geven aan dat SNP-ChIP ook directe informatie kan geven over de verdeling van eiwitten, in het bijzonder voor bindingspatronen op grotere schaal.

Globale Red1 niveaus zijn verlaagd in cohesine en hop1∆ mutanten

We wilden SNP-ChIP toepassen om mutant situaties te onderzoeken die een brede herverdeling van eiwitten veroorzaken. Herverdeling is een uitdaging voor traditionele kwantificatie methoden, zoals ChIP-qPCR, omdat het identificeren van regio’s die ongebonden blijven niet-triviaal is. In afwezigheid van de geconserveerde cohesine-subeenheid Rec8, verandert de verdeling van Red1 over het genoom dramatisch, met grote regio’s van depletie afgewisseld met dichte clusters van binding. Of de algemene binding van Red1 verandert in rec8∆ mutanten blijft echter onduidelijk. Wij gebruikten SNP-ChIP om deze vraag te beantwoorden en vonden een uitgesproken afname van de algemene Red1 bindingsniveaus (Fig. 3a). Directe vergelijking van de bezetting van Red1 langs twee voorbeeldchromosomen illustreert zowel de dramatische herverdeling als de algemene afname van Red1 binding in vergelijking met het wildtype (Fig. 3b). Zo Rec8-cohesine is essentieel voor de volledige chromosomale verrijking van Red1.

SNP-ChIP analyse in mutanten met grootschalige doelwit herverdeling. a Doeleiwit Red1 niveaus in een rec8∆ mutant ten opzichte van wildtype geproduceerd door SNP-ChIP. Punten vertegenwoordigen individuele repliceren waarden en bars vertegenwoordigen gemiddelde waarde. b Spike-in genormaliseerde fragment pileups in wild type en rec8 ∆ mutant stammen geproduceerd met behulp van MACS2 met SPMR (fragment pileup per miljoen leest) sequencing diepte normalisatie uitgezet op twee voorbeeld chromosomen. c Red1 niveaus in hop1 ∆ mutant ten opzichte van wild type geproduceerd door SNP-ChIP (als in a). d Spike-in genormaliseerde fragment pileups in wild type en hop1 ∆ mutant stammen (als in b). e Spike-in genormaliseerd gemiddeld Red1 signaal op individuele chromosomen in een hop1∆ mutant

Hop1 is een ander belangrijk eiwit van het axiale element van gist dat fysisch interageert met Red1 . Axiaal-element eiwitten worden gerekruteerd in grotere hoeveelheden aan kleine chromosomen, maar in de afwezigheid van Hop1, Red1 binding wordt minder afhankelijk van chromosoom grootte . Eerder werk met behulp van in silico schaling , suggereerde dat deze vermindering het gevolg was van een selectieve toename in Red1 rekrutering op grote chromosomen . Die schaling aanpak vereist echter de definitie van genomische regio’s die ongebonden zijn, wat moeilijk is vast te stellen met breed gedistribueerde chromosomale eiwitten zoals Red1. Daarom hebben we deze vraag opnieuw onderzocht door SNP-ChIP van Red1 uit te voeren in een hop1Δ mutant. SNP-ChIP reproduceerde de eerder gevonden verzwakking van chromosoom-grootte bias. De spike-in normalisatiefactor toonde echter een algemene afname van Red1 rekrutering tot 71,9 ± 4,2% van de wild-type Red1 hoeveelheid (Fig. 3c, d). Deze daling is sterker op kleine chromosomen (Fig. 3e). Wij merken op dat milde verlies van Red1 binding in het algemeen niet resulteert in een verlies van chromosoom-grootte bias, omdat schrapping van de histon-methyltransferases Set1 en Dot1 oorzaken vergelijkbaar ~ 20% reducties van de totale Red1 rekrutering niveaus, maar heeft geen invloed op de verdeling van Red1 binding tussen chromosomen (Additional file 4: Figuur S4). Deze gegevens suggereren dat verlies van Hop1 leidt tot een algemene vermindering van Red1 signaal over alle chromosomen die in het bijzonder van invloed op de drie kleinste chromosomen.

γ-H2AX niveaus veranderen niet in Red1 dosering stammenreeks

Om te testen of SNP-ChIP ook kwantitatieve analyses van eiwitmodificaties mogelijk maakt, richtten we ons op fosforylering van histon H2A op serine 129 (γ-H2AX). Deze modificatie wordt snel geïnduceerd na de vorming van DNA dubbelstrengsbreuken (DSB’s). In mitotische gist verspreidt de γ-H2AX modificatie zich ongeveer 50 kb aan weerszijden van een DSB. Bovendien wordt constitutief γ-H2AX gevonden nabij telomeren gedurende de gehele celcyclus. Om de distributie en DSB afhankelijkheid van γ-H2AX in meiose te analyseren, hebben we SNP-ChIP uitgevoerd in een wild type stam, evenals de Red1 doseringsreeks, die een milde (tot 30%) reductie in DSB niveaus vertoont , en een spo11-Y135F mutant, die codeert voor een katalytisch dood Spo11 eiwit, dat geen meiotische DSB’s vormt .

Meting van γ-H2AX niveaus in meiose toonde geen verschil tussen wild type en een van de stammen met verminderde Red1 niveaus, ongeacht de berekeningsmethode (Fig. 4a, b, c). Het uniforme signaal langs chromosomen is consistent met de verspreiding van de γ-H2AX markering van alle gist DSB hotspots, die zijn verdeeld over het hele genoom, en verklaart waarschijnlijk waarom een milde vermindering in DSB niveaus niet leidt tot een merkbare daling van de globale γ-H2AX signaal. De spo11-Y135F controle daarentegen vertoonde slechts ongeveer 25% van de wild-type γ-H2AX niveaus. Het signaal was duidelijk verrijkt naast de telomeren, terwijl de interstitiële regio’s slechts zwakke signalen vertoonden die waarschijnlijk verband hielden met genexpressie. Deze gegevens tonen aan dat het constitutieve telomeer-geassocieerde γ-H2AX signaal ook gehandhaafd blijft in de meiotische profase. Bovendien geeft het schalen van signaalsporen aan dat het telomeer-geassocieerde γ-H2AX signaal grotendeels onveranderd blijft in de spo11-Y135F mutant, consistent met het feit dat meiotische DSB-vorming bijna niet detecteerbaar is in deze regio’s. Samen tonen deze gegevens aan dat SNP-ChIP kwantitatieve vergelijkingen tussen ChIP-seq experimenten mogelijk maakt, ongeacht het antigeen en dus een veelzijdige methode biedt voor het meten van wereldwijde chromatine-associaties zonder de noodzaak van epitoop tags.

SNP-ChIP-analyse van een eiwitmodificatie. a γ-H2AX niveaus voor de Red1 dosering stamreeks en een spo11-Y135F mutant ten opzichte van wild type geproduceerd door SNP-ChIP. b Fragment pileup geproduceerd met behulp van MACS2 met SPMR (fragment pileup per miljoen reads) sequencing diepte normalisatie op een voorbeeld chromosoom na spike-in normalisatie. c Detail van gegevens in (b) met een zoom-in op de linker subtelomerische regio