Tandem massaspectrometrie

Fragmentatie van gasfase-ionen is essentieel voor tandemmassaspectrometrie en vindt plaats tussen verschillende stadia van massa-analyse. Er worden vele methoden gebruikt om de ionen te fragmenteren en deze kunnen resulteren in verschillende soorten fragmentatie en dus verschillende informatie over de structuur en samenstelling van het molecuul.

In-source fragmentatieEdit

Vaak is het ionisatieproces zo krachtig dat de resulterende ionen voldoende interne energie hebben om in de massaspectrometer te fragmenteren. Indien de productionen gedurende een gematigde tijd in hun niet-evenwichtstoestand blijven voordat zij automatisch worden gescheiden, wordt dit proces metastabiele fragmentatie genoemd. Met “nozzle-skimmer fragmentatie” wordt de doelbewuste inductie van fragmentatie bij de bron bedoeld door de potentiaal van de nozzle-skimmer te verhogen bij instrumenten die meestal op elektrospray zijn gebaseerd. Hoewel fragmentatie bij de bron fragmentatieanalyse mogelijk maakt, is het technisch gezien geen tandemmassaspectrometrie, tenzij metastabiele ionen vóór auto-dissociatie worden geanalyseerd of geselecteerd en een tweede analysestadium wordt uitgevoerd op de resulterende fragmenten. In-source fragmentatie kan worden gebruikt in plaats van tandemmassaspectrometrie door gebruik te maken van Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA)-technologie die fragmentatie genereert die direct overeenkomt met tandemmassaspectrometriegegevens. Fragmenten die met EISA worden waargenomen, hebben een hogere signaalintensiteit dan traditionele fragmenten die verliezen ondergaan in de botsingscellen van tandemmassaspectrometers. Met EISA kunnen fragmentatiegegevens worden verzameld op MS1-massa-analysatoren zoals time-of-flight- en enkelvoudige quadrupoolinstrumenten. In-source fragmentatie wordt vaak gebruikt naast tandemmassaspectrometrie (met post-source fragmentatie) om twee fragmentatiestappen mogelijk te maken in een pseudo MS3-type experiment.

Collision-induced dissociationEdit

Post-source fragmentatie is meestal wat wordt gebruikt in een tandemmassaspectrometrie experiment. Aan de ionen, die gewoonlijk reeds trillingsgeëxciteerd zijn, kan ook energie worden toegevoegd door middel van botsingen met neutrale atomen of moleculen na de bron, de absorptie van straling, of de overdracht of het vangen van een elektron door een meervoudig geladen ion. Door botsing geïnduceerde dissociatie (CID), ook wel door botsing geactiveerde dissociatie (CAD) genoemd, behelst de botsing van een ion met een neutraal atoom of molecuul in de gasfase en de daaropvolgende dissociatie van het ion. Neem bijvoorbeeld

AB + + M ⟶ A + B + + M {\displaystyle {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}

waarbij het ion AB+ botst met de neutrale stof M en vervolgens uiteenvalt. De details van dit proces worden beschreven door de botsingstheorie. Ten gevolge van verschillende instrumentele configuraties zijn twee belangrijke verschillende typen CID mogelijk: (i) bundeltype (waarbij de precursorionen tijdens de vlucht worden gefragmenteerd) en ii) ionenvaltype (waarbij de precursorionen eerst worden gevangen en vervolgens gefragmenteerd).

Een derde en recenter type CID-fragmentatie is de botsingsdissociatie met hogere energie (HCD). HCD is een CID-techniek die specifiek is voor orbitrap-massaspectrometers waarbij de fragmentatie buiten de ionenval plaatsvindt, zij gebeurt in de HCD-cel (in sommige instrumenten “ion routing multipole” genoemd). HCD is een fragmentatie van het trap-type waarvan is aangetoond dat het bundel-type eigenschappen heeft. Er bestaan vrij toegankelijke grootschalige databanken voor tandemmassaspectrometrie met hoge resolutie (b.v. METLIN met 850.000 moleculaire standaarden elk met experimentele CID MS/MS-gegevens), die gewoonlijk worden gebruikt om de identificatie van kleine moleculen te vergemakkelijken.

Elektronenvangst- en -overdrachtmethodenEdit

De energie die vrijkomt wanneer een elektron wordt overgedragen aan of gevangen door een meervoudig geladen ion, kan fragmentatie induceren.

ElektronenvangstdissociatieEdit

Als een elektron wordt toegevoegd aan een meervoudig geladen positief ion, wordt de Coulomb-energie vrijgemaakt. Het toevoegen van een vrij elektron wordt elektronenvangstdissociatie (ECD) genoemd, en wordt voorgesteld door

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragmenten {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}} links^{(n-1)+} rechts]^{*}{\ce {->fragmenten}}

voor een meervoudig geprotoneerd molecuul M.

Elektron-transferdissociatieEdit

Het toevoegen van een elektron via een ion-ion reactie wordt elektron-transferdissociatie (ETD) genoemd. Vergelijkbaar met elektronenvangstdissociatie induceert ETD fragmentatie van kationen (b.v. peptiden of proteïnen) door er elektronen aan over te dragen. Het is uitgevonden door Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka en Jarrod Marto aan de Universiteit van Virginia.

ETD maakt geen gebruik van vrije elektronen, maar gebruikt hiervoor radicale anionen (b.v. antraceen of azobenzeen):

n + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragmenten {{n+}+{\ce {A^{-}->}}}left^{(n-1)+}right]^{*}+{\ce {A->fragmenten}}

waarbij A het anion is.

ETD splijt willekeurig langs de peptide ruggengraat (c- en z-ionen) terwijl zijketens en modificaties zoals fosforylering intact worden gelaten. De techniek werkt alleen goed voor ionen met een hogere ladingstoestand (z>2), maar in vergelijking met botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) is ETD voordelig voor de fragmentatie van langere peptiden of zelfs hele eiwitten. Dit maakt de techniek belangrijk voor top-down proteomics. Net als ECD is ETD effectief voor peptiden met modificaties zoals fosforylering.

Electron-transfer and higher-energy collision dissociation (EThcD) is een combinatie van ETD en HCD waarbij de peptideprecursor aanvankelijk wordt onderworpen aan een ion/ion-reactie met fluorantheenanionen in een lineaire ionenval, die c- en z-ionen genereert. In de tweede stap wordt HCD all-ion fragmentatie toegepast op alle ETD afgeleide ionen om b- en y-ionen te genereren voorafgaand aan de uiteindelijke analyse in de orbitrap analyzer. Deze methode maakt gebruik van dubbele fragmentatie om ion- en dus gegevensrijke MS/MS-spectra te genereren voor peptide-sequencing en PTM-lokalisatie.

Negatieve elektron-transfer-dissociatieEdit

Fragmentatie kan ook optreden met een gedeprotoneerde species, waarbij een elektron wordt overgedragen van de species naar een kationisch reagens in een negatieve elektron-transfer dissociatie (NETD):

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragmenten {{n-}+{\ce {A+->}}-links^{(n+1)-}rechts]^{*}+{\ce {A->fragmenten}}

Na deze overdracht ondergaat het elektrongebrekkige anion een interne herschikking en fragmenteert. NETD is het ion/ion-analoog van elektron-afstootdissociatie (EDD).

NETD is geschikt voor fragmentatie van peptiden en eiwitten langs de ruggengraat bij de Cα-C-binding. De resulterende fragmenten zijn meestal a- en x-type productionen.

Electron-detachment dissociationEdit

Electron-detachment dissociation (EDD) is een methode voor het fragmenteren van anionogene soorten in massaspectrometrie. Het dient als een negatieve tegenmethode voor dissociatie door elektronenvangst. Negatief geladen ionen worden geactiveerd door bestraling met elektronen met gematigde kinetische energie. Het resultaat is het uitwerpen van elektronen uit het ionische moedermolecuul, wat dissociatie via recombinatie veroorzaakt.

Klading-overdracht dissociatieEdit

Reactie tussen positief geladen peptiden en kationische reagentia, ook wel bekend als lading-overdracht dissociatie (CTD), is onlangs aangetoond als een alternatieve hoge-energie fragmentatie route voor peptiden met een lage ladingstoestand (1+ of 2+). Het voorgestelde mechanisme van CTD met heliumkationen als reagens is:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragmenten {\displaystyle {{^{1}+}+He+->}}left^{2}+}}right]^{*}+{\ce {He^{0}->fragmenten}}

Eerste berichten zijn dat CTD de Cα-C-binding in de ruggengraat van peptiden verbreekt en productionen van het a- en x-type oplevert.

FotodissociatieEdit

De energie die nodig is voor dissociatie kan worden toegevoegd door absorptie van fotonen, wat resulteert in fotodissociatie van ionen en wordt voorgesteld door

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {{AB+}+{\mathit {h\nu }}->{A}+B+}}}

waar h ν {\displaystyle h\nu }}

staat voor het foton dat door het ion wordt geabsorbeerd. Ultraviolette lasers kunnen worden gebruikt, maar kunnen leiden tot overmatige fragmentatie van biomoleculen.

Infrarood-multifotondissociatieEdit

Infraroodfotonen zullen de ionen verhitten en dissociatie veroorzaken als er genoeg van worden geabsorbeerd. Dit proces wordt infrarood-multifotondissociatie (IRMPD) genoemd en wordt vaak uitgevoerd met een kooldioxidelaser en een ion trapping massaspectrometer zoals een FTMS.

Blackbody infrarood radiatieve dissociatieEdit

Blackbody straling kan worden gebruikt voor fotodissociatie in een techniek die bekend staat als blackbody infrarood radiatieve dissociatie (BIRD). Bij de BIRD-methode wordt de gehele vacuümkamer van de massaspectrometer verwarmd om infrarood licht te creëren. BIRD gebruikt deze straling om steeds energetischere trillingen van de ionen op te wekken, totdat een binding verbreekt en fragmenten worden gevormd. Dit is vergelijkbaar met infrarood-multifotondissociatie, waarbij ook infrarood licht wordt gebruikt, maar van een andere bron. BIRD wordt meestal gebruikt bij Fourier transform ion cyclotron resonantie massaspectrometrie.

Oppervlakte-geïnduceerde dissociatieEdit

Bij oppervlakte-geïnduceerde dissociatie (SID) is de fragmentatie het resultaat van de botsing van een ion met een oppervlak onder hoog vacuüm. Tegenwoordig wordt SID gebruikt om een breed scala van ionen te fragmenteren. Jaren geleden was het alleen gebruikelijk SID toe te passen op ionen met een lagere massa en met één lading, omdat de ionisatiemethoden en de technologie van de massa-analysator nog niet geavanceerd genoeg waren om ionen met een hoge m/z op de juiste wijze te vormen, door te geven of te karakteriseren. In de loop der tijd zijn zelfgeassembleerde monolaagoppervlakken (SAM’s) bestaande uit CF3(CF2)10CH2CH2S op goud de meest gebruikte botsingsoppervlakken voor SID in een tandem spectrometer geweest. SAM’s fungeren als de meest wenselijke botsingsoppervlakken vanwege hun karakteristiek grote effectieve massa’s voor de botsing van inkomende ionen. Bovendien zijn deze oppervlakken samengesteld uit starre fluorkoolstofketens, die de energie van de projectielionen niet noemenswaardig dempen. De fluorkoolstofketens zijn ook gunstig vanwege hun vermogen om weerstand te bieden aan een gemakkelijke elektronenoverdracht van het metaaloppervlak naar de inkomende ionen. Het vermogen van SID om subcomplexen te produceren die stabiel blijven en waardevolle informatie over connectiviteit verschaffen, wordt door geen enkele andere dissociatietechniek geëvenaard. Aangezien de met SID geproduceerde complexen stabiel zijn en de ladingsverdeling op het fragment behouden blijft, levert dit een uniek, spectra op waarin het complex zich centreert rond een smallere m/z-verdeling. De SID-producten en de energie waarbij zij worden gevormd, weerspiegelen de sterkte en de topologie van het complex. De unieke dissociatiepatronen helpen de quartaire structuur van het complex te ontdekken. De symmetrische ladingsverdeling en dissociatie-afhankelijkheid zijn uniek voor SID en maken de geproduceerde spectra onderscheidend van elke andere dissociatietechniek.

De SID-techniek is ook toepasbaar op ion-mobiliteit massaspectrometrie (IM-MS). Drie verschillende methoden voor deze techniek omvatten het analyseren van de karakterisering van topologie, intersubunit connectiviteit, en de mate van ontvouwing voor eiwitstructuur. De analyse van de ontvouwing van de eiwitstructuur is de meest gebruikte toepassing van de SID-techniek. Voor ion-mobiliteit massaspectrometrie (IM-MS) wordt SID gebruikt voor dissociatie van de door de bron geactiveerde precursors van drie verschillende soorten eiwitcomplexen: C-reactief proteïne (CRP), transthyretine (TTR), en concanavalin A (Con A). Deze methode wordt gebruikt om de ontvouwingsgraad voor elk van deze complexen te observeren. Voor deze waarneming toonde SID de structuren van de voorloper-ionen die vóór de botsing met het oppervlak bestaan. IM-MS gebruikt de SID als een directe maatstaf voor de conformatie van de subeenheden van elk eiwit.

Fourier-transformatie ion cyclotron resonantie (FTICR) is in staat ultrahoge resolutie en hoge massanauwkeurigheid te leveren aan instrumenten die massametingen uitvoeren. Deze eigenschappen maken FTICR-massaspectrometers tot een nuttig instrument voor een grote verscheidenheid van toepassingen, zoals verschillende dissociatie-experimenten zoals botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID), elektronenoverdrachtsdissociatie (ETD), en andere. Bovendien is oppervlakte-geïnduceerde dissociatie met dit instrument geïmplementeerd voor de studie van fundamentele peptidefragmentatie. Meer in het bijzonder is SID toegepast voor de studie van de energetica en de kinetica van fragmentatie in de gasfase in een ICR-instrument. Deze aanpak is gebruikt om de gasfase fragmentatie van geprotoneerde peptiden, oneven-elektron peptide ionen, niet-covalente ligand-peptide complexen, en geligeerde metaalclusters te begrijpen.