Identification, Characterization, and Verification of Proteins 130 and 131 as 14-3-3
Figuur 1.
Figuur 1. Regio’s van zilverbehandelde gels die na tweedimensionale elektroforese de proteïnespots 130 en 131 laten zien.
Paneel A toont normale cerebrospinale vloeistof, met vlekken 130 en 131 afwezig. Paneel B toont cerebrospinaal vocht van een patiënt met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob; de pijlen wijzen naar de vlekken 130 en 131. De gels in de Panelen C en D zijn van een extract van normale menselijke hersenen. Panelen A, B en C tonen hetzelfde gelgebied, met iso-elektrische punten variërend van 4,8 tot 6,0 (van links naar rechts) op de x-as, en afmetingen variërend van 10 tot 40 kd (van onder naar boven) op de y-as. Het gestippelde vak in Paneel C omlijnt het gebied in Paneel D van een gel met een pH-bereik van 4,5 tot 5,4. De pijlen in Panelen B en C geven de locatie aan van vlekken 130 en 131, die gelabeld zijn in Paneel D.
De resultaten van tweedimensionale elektroforese voor de detectie van cerebrospinale vloeistof eiwitten 130 en 131 bij patiënten met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob worden getoond in Figuur 1A en Figuur 1B. Recente technische verbeteringen hebben geresulteerd in een verhoogde resolutie, met zes spots in plaats van de twee (die overeenkomen met de eiwitten 130 en 131) oorspronkelijk beschreven. Om een overvloedige bron van deze eiwitten te vinden, hebben wij normaal hersenweefsel onderzocht om te bepalen of er eiwitten van de hersenen zijn gelokaliseerd in de buurt van de constellatie van vlekken die overeenkomen met de cerebrospinale vloeistof eiwitten 130 en 131. Figuur 1C toont een gebied van een zilver-gekleurde gel na tweedimensionale elektroforese van normale hersenen eiwitten. Verschillende van de eiwitten verschijnen in hetzelfde gebied als de 130-131 constellatie, waaronder twee die dezelfde lading en massa hebben als de 130-131 constellatie in cerebrospinale vloeistof. De identificatie van de twee spots op basis van hun positie werd bevestigd door comigratiestudies. Spikkel 130 werd gezuiverd door middel van smal-bereik tweedimensionale elektroforese (pH-bereik, 4,5 tot 5,4), zoals getoond in figuur 1D.
Spikkel 130 werd uit 10 vlekken gehaald, enzymatisch verteerd, en van een microsequentie voorzien. Aminozuursequenties werden verkregen uit vier peptidefragmenten. Drie van deze sequenties, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys, en Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, kwamen overeen met de sequentie van het menselijke 14-3-3 eiwit, isovorm eta. De vierde sequentie, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, kwam overeen met het runder 14-3-3-eiwit, isovorm gamma.
Het 14-3-3-antilichaam reageerde specifiek met cerebrospinale vloeistof-eiwitten 130 en 131 op een tweedimensionale elektroforetische immunoblot, maar reageerde niet met andere cerebrospinale vloeistof-eiwitten, waarmee werd geverifieerd dat cerebrospinale vloeistof-eiwitten 130 en 131 14-3-3-eiwitten zijn.
14-3-3-immunoassay
Figuur 2.
Figuur 2. Immunokleuring voor anti-14-3-3β polyklonaal konijn-antilichaam na natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide-gelelektroforese.
Laan 1 toont cerebrospinaal vocht van een patiënt met pathologische aanwijzingen voor de ziekte van Alzheimer, banen 2 en 3 tonen cerebrospinaal vocht van twee patiënten met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob, baan 4 toont cerebrospinaal vocht van een normale koe, baan 5 toont cerebrospinaal vocht van een koe met experimenteel opgewekte overdraagbare nertsencefalopathie en pathologische aanwijzingen voor spongiforme ziekte, laan 6 toont normaal menselijk serum, laan 7 toont serum van een patiënt met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob, laan 8 toont een extract van normale menselijke hersenen, en laan 9 toont gezuiverd prioneiwit uit de hersenen van een patiënt met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob.
De ontdekking dat de cerebrospinale vloeistof 30-kd vlekken (eiwitten 130 en 131) 14-3-3 eiwitten zijn, leidde tot de ontwikkeling van een eenvoudige immunoassay om te helpen bij de diagnose van overdraagbare spongiforme encefalopathie. Zoals uit figuur 2 blijkt, was er in cerebrospinaal vocht van patiënten met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob een 30-kd immunoreactieve band (lanen 2 en 3), terwijl een dergelijke band niet werd aangetroffen in cerebrospinaal vocht van gezonde controles (gegevens niet weergegeven) of van een patiënt met de ziekte van Alzheimer (laan 1). Zoals verwacht was 14-3-3 overvloedig aanwezig in een extract van normale menselijke hersenen (laan 8). Het 14-3-3-eiwit werd niet aangetroffen in normaal serum (laan 6); het werd echter ook niet gedetecteerd in serum van patiënten met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob (laan 7). Prioneiwit gezuiverd uit de hersenen van een patiënt met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob (baan 9) vertoonde geen kruisreactie met 14-3-3-antilichaam, hetgeen bevestigt dat 14-3-3 geen prioneiwit is.
Tabel 1.
Tabel 1. Cerebrospinal Fluid Samples Evaluated with the 14-3-3 Immunoassay, According to Diagnosis. Tabel 2.
Tabel 2. Gevoeligheid en specificiteit van de 14-3-3 Immunoassay voor de ziekte van Creutzfeldt-Jakob.
Achtenzestig van 71 cerebrospinale vloeistofstalen van patiënten met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob (96 procent) waren positief voor 14-3-3 (Tabel 1 en Tabel 2). Vier van de 94 monsters (4 procent) van patiënten met andere ziekten met dementie waren positief voor 14-3-3 (Tabel 1 en Tabel 2) (P<0,001). Bovendien, wanneer patiënten met dementie waarvan bekend was dat ze acute herseninfarcten hadden gehad binnen een maand voor het testen werden uitgesloten van de analyse, was slechts 1 van de 91 monsters (1 procent) positief (P<0.001). Monsters van alle 10 patiënten met multi-infarct dementie maar zonder beroertes in de maand voor de test waren negatief voor 14-3-3. Het enige fout-positieve resultaat onder de hersenvochtmonsters van de andere patiënten met dementie was van een patiënt met een klinische diagnose van de ziekte van Alzheimer die niet was geverifieerd door pathologisch onderzoek.
14-3 werd gedetecteerd in 18 van de 66 hersenvochtmonsters (27 procent) van patiënten met andere neurologische aandoeningen waarbij geen sprake was van dementie. De 18 positieve monsters waren afkomstig van patiënten met acute virale encefalitis, beroerte (zonder dementie) binnen een maand voor de test, subarachnoïdale bloeding, of het syndroom van Rett. De ziekte van Creutzfeldt-Jakob kon redelijkerwijs niet worden opgenomen in de differentiële diagnose van een van deze aandoeningen.
Over het geheel genomen was de gevoeligheid van de 14-3-3 immunoassay als een marker voor de ziekte van Creutzfeldt-Jakob 96 procent (68 echte positieve resultaten gedeeld door 71 echte positieve en valse negatieve resultaten; 95 procent betrouwbaarheidsinterval, 92 tot 99 procent), en de specificiteit was 88 procent (164 echte negatieve resultaten gedeeld door 186 echte negatieve en valse positieve resultaten; 95 procent betrouwbaarheidsinterval, 84 tot 92 procent). Belangrijker nog, de specificiteit van deze assay onder alle patiënten met dementie was 96 procent (90 waarnegatieve resultaten gedeeld door 94 waarnegatieve en vals-positieve resultaten; 95 procent betrouwbaarheidsinterval, 90 tot 96 procent), en wanneer de drie patiënten met dementie en herseninfarct binnen een maand voor het testen werden uitgesloten, was de specificiteit van de immunoassay 99 procent (90 waarnegatieve resultaten gedeeld door 91 waarnegatieve en vals-positieve resultaten; 95 procent betrouwbaarheidsinterval, 97 tot 100 procent) (tabel 1 en tabel 2).
Vergelijking van tweedimensionale elektroforese en immunoassay
Tabel 3.
Tabel 3. Vergelijking van de tweedimensionale elektroforese voor de eiwitten 130 en 131 en de 14-3-3-immunoassay.
Wij vergeleken de tweedimensionale elektroforetische bepaling voor de eiwitten 130 en 131 met de 14-3-3 immunoassay in 50 cerebrospinale vloeistofmonsters (Tabel 3). Dertien van de 15 monsters van patiënten met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob waren positief met beide tests, en de andere 2 monsters waren negatief voor de eiwitten 130 en 131 maar positief voor het 14-3-3 eiwit. De resultaten van de twee testen waren hetzelfde bij monsters van patiënten met dementie die niet geassocieerd was met de ziekte van Creutzfeldt-Jakob of andere neurologische aandoeningen. Hoewel de specificiteiten van de twee testen gelijk zijn, heeft de 14-3-3 immunoassay een iets hogere gevoeligheid.
14-3-3 Immunoassay in Dieren
Tabel 4.
Tabel 4. Results of the 14-3-3 Immunoassay in Cerebrospinal Fluid Samples from Animals.
De resultaten van de studies bij dieren waren consistent met die van de studies bij mensen. Figuur 2 toont de assayresultaten in cerebrospinale vloeistof van een normale koe (laan 4) en een koe met pathologische aanwijzingen voor overdraagbare spongiforme encefalopathie (laan 5). Zoals tabel 4 laat zien, werd 14-3-3-eiwit aangetoond in cerebrospinaal vocht van zes van de negen runderen met experimenteel opgewekte overdraagbare nertsenencefalopathie of scrapie. De ene koe met klinische kenmerken maar zonder pathologisch bewijs van overdraagbare spongiforme encefalopathie had ook een positieve test. Geen enkele controlekoe had een positieve test. De test was positief bij vijf van de zes schapen met op natuurlijke wijze verworven scrapie en was negatief bij het ene controlegeschaap. Alle 15 experimenteel besmette chimpansees hadden een positieve test, terwijl dat bij geen van de 77 controlechimpansees het geval was. De algemene gevoeligheid van de 14-3-3 immunoassay bij dieren was 87 procent, en de algemene specificiteit was 99 procent.