Abstract
Glycogen phosphorylase is een belangrijk enzym voor het koolhydraatmetabolisme in de spieren. Het gebruikt anorganisch fosfaat om glucose uit glycogeen te verwijderen, waarbij glucose-1-fosfaat wordt geproduceerd, dat kan worden gebruikt voor de productie van ATP. Inactief glycogeen fosforylase (fosforylase h) wordt geactiveerd door de allosterische binding van 5′-AMP, of door fosforylering door fosforylase kinase (PhK). Fosforylering produceert fosforylase a, dat actief is in afwezigheid van AMP. PhK is het enige kinase dat fosforylase b kan fosforyleren, dat op zijn beurt het enige substraat is voor PhK. In dit proefschrift is getracht de redenen voor deze specificiteit vast te stellen en hoe deze twee enzymen elkaar herkennen, door site-directed mutanten van glycogeen fosforylase te bestuderen;Alle mutanten werden onderzocht op veranderingen in hun interactie met een afgeknotte vorm van de katalytische subeenheid van fosforylase kinase, gamma(1–300). Drie mutaties (R69K, R69E, en E501A), aangebracht op plaatsen die interageren met de amino terminus in fosforylase b of a, vertoonden weinig verschil in fosforylering door gamma(1–300) in vergelijking met fosforylase b. Vijf mutaties, aangebracht op drie plaatsen in de amino-terminale staart van fosforylase (K11A, K11E, I13G, R16A, en R16E), leidden echter tot een afname van de katalytische efficiëntie voor gamma(1–300), vergeleken met fosforylase b. R16E was het slechtste substraat voor gamma(1–300), met een 47-voudige afname van de katalytische efficiëntie. De amino-terminus, en vooral Arg 16, zijn zeer belangrijke factoren voor de herkenning van fosforylase door gamma(1–300). Bovendien konden I13G en R16A gefosforyleerd worden door proteïne kinase A, dat inheems fosforylase niet herkent; bij sommige mutanten werd ook een veranderde conformatie vastgesteld. R16A en R16E werden geactiveerd bij een zeer lage AMP-concentratie en kristalliseerden bij lage temperatuur, zoals fosforylase a. Dit wijst erop dat hun structuren zelfs zonder fosforylering meer lijken op fosforylase a dan op fosforylase b. Twee andere mutanten vertoonden het tegenovergestelde effect en gedroegen zich na fosforylering als fosforylase b. R69E werd slechts gedeeltelijk geactiveerd door fosforylering, en I13G was volledig inactief na fosforylering. I13G was de eerste waarneming van een fosforylase vorm die niet kon worden geactiveerd door fosforylering.