Inleiding
Een gemakkelijke en efficiënte synthese van biologisch actieve moleculen is een van de belangrijkste doelstellingen van de organische en medicinale chemie. In de afgelopen jaren zijn multicomponent reacties een van de belangrijke hulpmiddelen geworden bij de synthese van structureel diverse chemische bibliotheken van geneesmiddelachtige polyfunctionele organische moleculen. Bovendien bieden MCR’s in verschillende opzichten het voordeel van eenvoud en synthetische efficiëntie ten opzichte van conventionele chemische reacties. MCR’s maken de bouw van combinatorische bibliotheken van complexe organische moleculen voor een efficiënte lead structuur identificatie en optimalisatie in drug discovery.
In de voortzetting van ons lopende onderzoek naar microgolf geassisteerde synthese van nanomaterialen hebben we ontdekt dat, nano-kristallijne metaaloxiden hebben aanzienlijke aandacht getrokken van synthetische en medicinale chemici vanwege hun hoge katalytische activiteit en herbruikbaarheid. Zinkoxide is een goedkoop, vochtbestendig, herbruikbaar, commercieel beschikbaar en is niet-toxisch, onoplosbaar in zowel polaire als apolaire oplosmiddelen. Een breed scala van organische reacties, waaronder Beckmann rearrangements , N-benzylering , acylering , dehydratie van oximen , nucleofiele ringopening reacties van epoxiden , synthese van cyclische ureum , N-formylering van amines . In het bijzonder kristallijn nano-ZnO-oxide vertonen betere katalytische activiteit in vergelijking met hun bulk formaat tegenhangers .
In de afgelopen jaren is veel aandacht besteed aan de synthese van dihydropyridine verbindingen als gevolg van hun enorme toepassing in verschillende onderzoeksgebieden met inbegrip van biologische wetenschap en medicinale chemie . Veel DHP’s zijn reeds commerciële producten zoals: amlodipine, felodipine, isradipine, lacidipine, nicardipine, nitrendipine, nifedipine en nimodipine B, waarvan nitrendipine en nemadipine B krachtige calciumkanaalblokkeringsactiviteiten vertonen (figuur 1) en zich hebben ontwikkeld tot een van de belangrijkste klassen van geneesmiddelen voor de behandeling van hart- en vaatziekten . Bovendien bezitten dihydropyridinederivaten een verscheidenheid van biologische activiteiten zoals geroprotectieve, hepatoprotectieve, anti-atherosclerotische, antitumor, en antidiabetische activiteiten. Wijdverspreide studies hebben aan het licht gebracht dat dihydropyridine-eenheid bevattende verbindingen verschillende medicinale functies vertonen zoals neuroprotectant, bloedplaatjes anti-aggregatoire activiteit, cerebrale anti-ischemische activiteit bij de behandeling van de ziekte van Alzheimer, chemosensibilisator bij tumortherapie. Drug-resistance modifiers , anti-oxidanten en een geneesmiddel voor de behandeling van urinaire incontinentie .
Figuur 1.
Geneesmiddelen die 1,4-DHP-moleculen bevatten.
Om deze biologische eigenschappen te modelleren en te begrijpen en om nieuwe chemotherapeutische middelen te ontwikkelen op basis van de 1,4-DHP-verbindingen, is veel moeite gedaan om effectieve methoden voor de synthese ervan te ontwikkelen. In het algemeen werden 1,4-DHP’s gesynthetiseerd met de methode van Hantzsch, waarbij cyclocondensatie van een aldehyde, een β-ketoester en ammoniak hetzij in azijnzuur hetzij onder terugvloeiing in alcoholen gedurende lange reactietijden plaatsvindt, hetgeen meestal tot lage opbrengsten leidt. Andere methoden omvatten het gebruik van microgolven , hoge temperaturen bij reflux , organokatalysatoren en metaaltriflaten .
Recentelijk is DNA een belangrijk doelwit voor geneesmiddelen en het reguleert vele biochemische processen die in het cellulaire systeem plaatsvinden. Interacties van kleine moleculen met DNA worden nog steeds intensief en op grote schaal bestudeerd voor hun nut als sondes van cellulaire replicatie en transcriptieregulatie en voor hun potentieel als geneesmiddelen. In het bijzonder is het ontwerpen van verbindingen op basis van hun vermogen om DNA te klieven van groot belang, niet alleen vanuit primair biologisch oogpunt, maar ook in termen van fotodynamische therapeutische benadering om krachtige geneesmiddelen te ontwikkelen . 1,4-Dihydropyridinederivaten hebben de aandacht van de chemici getrokken wegens hun diverse biologische toepassingen. Het biologische belang van deze klasse van verbindingen heeft ons ertoe aangezet deze reeks uit te breiden door te werken aan de synthese en DNA fotocleavage studies van 1,4-dihydropyridinederivaten. In deze mededeling zijn de synthese van 1,4-dihydropyridinederivaten en hun DNA fotocleavagestudies en moleculaire docking gerapporteerd.
In de literatuur zijn er verschillende methoden bekend voor de synthese van 1,4-dihydropyridinederivaten. In het verlengde van ons programma over de chemie van nanomateriaal, melden wij hier een efficiënte microgolfmethode voor de synthese van kristallijne ZnO-NPs. Het in dit werk gebruikte ZnO werd gesynthetiseerd volgens een gewijzigde methode. De bereide kristallijne ZnO-nanodeeltjes werden gekarakteriseerd met behulp van poeder XRD, SEM, EDX (figuur 2). Onze synthetische aanpak begon met de condensatie van 1 equiv. benzaldehyde 1a met 2 equiv. ethylacetoacetaat 2a en 2 equiv. NH4OAc 3a in aanwezigheid van ZnO-Nps resulteerde in de vorming van Hantzsch 1,4-dihydropyridine 4a (figuur 3). De reactie was in 5 min. voltooid onder microgolfbestraling en het product werd met de gebruikelijke bewerking geïsoleerd, met een opbrengst van 90% en een hoge zuiverheid. Onder vergelijkbare omstandigheden reageerden verschillende gesubstitueerde aromatische aldehyden met hetzij elektron-donerende of -onttrekkende substituenten met 1,3-diketonen om 1,4-DHP’s te vormen in goede tot uitstekende opbrengsten, en de resultaten zijn samengevat in tabel 1.
Figuur 2.
(a) Poeder XRD van verkregen ZnO nanodeeltjes door microgolf methode; (b) SEM beelden van ZnO-NPs; (c) EDX analyse spectrum van verkregen ZnO nanodeeltjes door microgolf methode.
Figuur 3.
Synthese van 1,4-dihydropyridines.
| Entrya | R | R1 | Producten | Entrya | Opbrengst (%)b |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | C6H5 | t-Bu | 4a | 1 | 90 |
| 2 | 4-MeO-C6H5 | t-Bu | 4b | 2 | 95 |
| 3 | 4-OH-C6H5 | t-Bu | 4c | 3 | 95 |
| 4 | 4-F-C6H5 | t-Bu | 4d | 4 | 95 |
| 5 | 4-Cl-C6H5 | t-Bu | 4e | 5 | 90 |
| 6 | 4-NO2-C6H5 | t-Bu | 4f | 6 | 95 |
| 7 | C6H5 | Et | 4 g | 7 | 90 |
| 8 | 4-MeO-C6H5 | Et | 4 h | 8 | 95 |
| 9 | 4-OH-C6H5 | Et | 4i | 9 | 92 |
| 10 | 4-F-C6H5 | Et | 4j | 10 | 92 |
| 11 | 4-Cl-C6H5 | Et | 4 k | 11 | 90 |
| 12 | 4-NO2-C6H5 | Et | 4 l | 12 | 90 |
| 13 | C6H5 | Me | 4 m | 13 | 90 |
| 14 | 4-MeO-C6H5 | Me | 4n | 14 | 87 |
| 15 | 4-OH-C6H5 | Me | 4o | 15 | 90 |
| 16 | 4-F-C6H5 | Me | 4p | 16 | 90 |
| 17 | 4-Cl-C6H5 | Me | 4q | 17 | 90 |
| 18 | 4-NO2-C6H5 | Me | 4r | 18 | 90 |
Tabel 1.
Synthese van 1,4-dihydropyridines.
aAlle producten werden gekarakteriseerd door 1H NMR- en 13C NMR-onderzoeken en vergeleken met de mps uit de literatuur. b Opbrengsten van geïsoleerde producten
Een door microgolfstraling ondersteund proces minimaliseert zeer vaak de vorming van bijproducten en vergt veel minder tijd dan thermische methoden. De belangrijkste voordelen van het uitvoeren van reacties onder gecontroleerde omstandigheden in verzegelde vaten zijn de aanzienlijke snelheidsverhogingen en de hogere produktopbrengsten die vaak kunnen worden bereikt. Daarom hebben we, in het verlengde van onze studies naar microgolfsynthese van nanomaterialen, geprobeerd een snel, microgolf-geassisteerd protocol te ontwikkelen voor de synthese van 1,4-DHP’s met behulp van kristallijne ZnO-nano katalysator (figuur 3).
De DNA-splitsing van 1,4-DHP derivaten werd bestudeerd met agarose gelelektroforese. Wanneer circulair plasmide-DNA aan elektroforese werd onderworpen, werd een relatief snelle migratie waargenomen voor het intacte supergecoileerde DNA (type I). Als splitsing op één streng optreedt (nicking), zal het supergecoileerde DNA ontspannen en een langzamer bewegende open cirkelvorm genereren (type II). Als beide strengen worden gesplitst, ontstaat een lineaire vorm (type III) die migreert tussen type I en type II. De omzetting van type I (supercoiled) naar type II (nicked circulair) werd waargenomen met verschillende concentraties 1,4-DHP en gedurende 2 uur bestraald in 1:9 DMSO/trisbuffer (20 μM, pH- 7,2) bij 365 nm. Er werd geen DNA-splitsing waargenomen bij de controle waarin 1,4-DHP afwezig was (laan 1) (figuur 4). Met toenemende concentratie van deze 1,4-DHP nam de hoeveelheid type I van pUC 19-DNA geleidelijk af, terwijl type II toenam (figuur 4).
Bij een concentratie van 40 μM kan de verbinding (4c) slechts 30% omzetting van DNA van type I in II bevorderen (figuur 5). Bij een concentratie van 80 μM kan verbinding (4c) bijna de omzetting van ongeveer 80% van DNA van type I naar II bevorderen (figuur 5). Het splitsingspotentieel van de testverbindingen werd beoordeeld door de banden te vergelijken die verschenen in de controle- en testverbindingen bij een concentratie van 80 μM. De andere derivaten vertonen echter een veel lagere klievende efficiëntie voor pUC 19 DNA. Zelfs bij een concentratie van 80 μM kan het slechts 40% omzetting van DNA van type I naar II bevorderen (figuur 5).
Maar bij hogere concentraties rond 130 μM worden de verbindingen geprecipiteerd en is er geen moment in het DNA. Het beeld (figuur 6) toont duidelijk aan dat verbindingen (4b, 4c, 4d, 4e, 4f en 4 g) DNA-splitsing van pUC19-DNA vertonen bij een concentratie van 80 μM. De resultaten geven aan dat verbindingen met -OCH3 en -OH op de -para positie van de fenyl ring (C-6) het DNA volledig hebben gesplitst, andere verbindingen hebben bijna volledige splitsing van DNA laten zien. Over het algemeen geeft het aan dat de alkoxy groepen zeer reactieve radicalen zijn, die efficiënt waterstofatomen onttrekken aan C-4′ van 2-deoxyribose. Het is van belang op te merken dat hydroxylgroep is gemeld om zuurstofradicaal gemedieerde DNA-beschadiging in aanwezigheid van fotostraling te bewerkstelligen.
De structuur-activiteitsrelatie studies van 1,4-DHP’s met betrekking tot DNA fotocleavage studies toont aan dat, de veranderingen in het substitutiepatroon op C-3, C-4, en C-5 posities de 1,4-DHP ring veranderen. Osiris Property Explorer is zo’n kennisgebaseerd activiteitsvoorspellend instrument dat de geneesmiddelwaarschijnlijkheid, de geneesmiddelenscore en ongewenste eigenschappen zoals mutagene, tumorigene, irriterende en voortplantingseffecten van nieuwe verbindingen voorspelt op basis van chemische fragmentgegevens van beschikbare geneesmiddelen en nietgeneesmiddelen zoals gerapporteerd (tabel 2) . Er werd waargenomen dat de verbindingen met alifatische groepen zoals -CH3, -COOCH3, -COOC2H5 en -COOC(CH3)3, vastgehecht aan C-2 en C-3 van 1,4-DHP goede activiteit vertoonden. Andere derivaten die een elektron-donerende substituent bezitten, zoals een hydroxy- en een methoxygroep aan de fenylring (C-6), verhogen de DNA-fotocleavageactiviteit. Een lone paar elektronen op het zuurstofatoom van de methoxygroep delokaliseert naar de π-ruimte van de benzeenring, waardoor de activiteit toeneemt. Evenzo verlagen elektrononttrekkende substituenten, zoals 4-fluorofenyl, 4-chloorfenyl van 1,4-DHP de activiteit. Deze resultaten geven aan dat de alkoxy-substituenten en de stikstof van de pyridinering in de 1,4-DHP-structuur verantwoordelijk zijn voor de DNA-splitsing.
Om de waargenomen spectroscopische resultaten te rationaliseren en meer inzicht te krijgen in de intercalatiemodaliteit, werden de 1,4-DHP (4a-r) achtereenvolgens in de DNA duplex van de sequentie d(CGCGAATTCGCG)2 dodecamer (PDB ID: 1BNA) gedockt om de gekozen bindingsplaats te voorspellen, samen met de voorkeursoriëntatie van het ligand in de kleine groef van het DNA. Alle gesynthetiseerde 1,4-DHP-derivaten werden getekend in ChemSketch en de structuren werden opgeslagen in .mol-formaat. Daarna werd het .mol-formaat gebruikt in Hyperchem-7, om hun fragmenten aan te passen, gevolgd door totale energieminimalisatie van liganden, zodat zij een stabiele conformatie kunnen bereiken en het bestand werd opgeslagen in .pdb-formaat.
Proteïne 3D-structuur van B-DNA werd verkregen van RCSB PDB (een informatieportaal voor biologische macromoleculaire structuren). De watermoleculen werden uit het bestand verwijderd, en het eiwit werd in 3D geprotoneerd om polaire waterstofverbindingen toe te voegen. De bindingspocket werd geïdentificeerd met behulp van site finder, en de respectieve residuen werden geselecteerd. Docking parameters werden ingesteld op standaardwaarden en scoringsalgoritme, de docking runs werden tot 30 conformaties per ligand behouden. De gedockte eiwitstructuren werden opgeslagen in .pdb formaat, en de ligandconformaties werden één voor één onderzocht. Complexen met de beste conformaties werden geselecteerd op basis van de hoogste score, laagste bindingsenergie en minimale RMSD waarden.
De gesynthetiseerde organische verbindingen voeren hun biologische activiteit efficiënter uit door respectieve eiwitten of DNA op hun specifieke bindingsplaats te binden. Identificatie van interagerende residuen met liganden is een noodzakelijke stap in de richting van het rationeel ontwerpen van geneesmiddelen, het begrijpen van de moleculaire route en de mechanistische werking van eiwitten.
Moleculaire docking werd uitgevoerd tussen starre receptor eiwitten en de flexibele liganden. Tabel 3 toont de details van de docking resultaten inclusief RMSD en bindingsenergiewaarden van eiwit-ligand complexen. De liganden (4b, 4c, 4h, 4i, 4n en 4o) binden sterk aan B-DNA zoals blijkt uit hun minimale bindingsenergiewaarden, respectievelijk -13,8, -12,9 en – 12,3 kcal/mol (figuur 7).
Figuur 7.
1,4-DHP werd achtereenvolgens in de DNA-duplex van de sequentie d(CGCGAATTCGCG)2 dodecamer (PDB ID: 1BNA) gedockt.
Figuur 8 toont de positie van de actieve plaats in de spiraalvormige structuur van DNA en laat ook zien dat alle gedockte liganden in de zak geclusterd zijn. Figuur 8 toont de waterstofbruginteractie van 4c en 4d met sleutelresiduen in de actieve zone binnen de spiraalvormige structuur van DNA. In dit model is duidelijk te zien dat de verbinding 4c een waterstofbrug heeft gevormd tussen de -OH en N1 van thymine, welke DT7 en DT19 zijn met een bindingslengte van respectievelijk 2,02 en 2,05 Ǻ. Bovendien vormden de andere derivaten van 1,4-DHP minder H-bondinteractie met het DNA vanwege de oriëntatie van de aromatische ring die betrokken is bij van der Waals-interacties (Wireframe-model) en vlakke hydrofobe gebieden van de bindingsplaatsen van het DNA (tabel 3). Deze resultaten toonden aan dat de in silico moleculaire docking studies van 1,4-DHPs met B-DNA suggereerden dat 1,4-DHPs het potentieel bezitten om hydrofobe en H-bond interacties te verstoren waardoor de stabiliteit van de aanhechting van B-DNA wordt beïnvloed, en effectief kunnen zijn voor kankercellijnen.
Figuur 8.
Interactie van 1,4-DHP met DNA-duplex van sequentie d(CGCGAATTCGCG)2 dodecamer (PDB ID: 1BNA).