Belangrijkste enzymen en componentenEdit
Het proces van V(D)J recombinatie wordt gemedieerd door VDJ recombinase, dat een diverse verzameling enzymen is. De belangrijkste enzymen die hierbij betrokken zijn, zijn recombinatie-activerende genen 1 en 2 (RAG), terminaal deoxynucleotidyl transferase (TdT), en Artemis nuclease, een lid van de alomtegenwoordige niet-homologe eindverbinding (NHEJ) route voor DNA reparatie. Van verscheidene andere enzymen is bekend dat zij bij het proces betrokken zijn, waaronder DNA-afhankelijk proteïnekinase (DNA-PK), X-ray repair cross-complementing protein 4 (XRCC4), DNA-ligase IV, non-homologous end-joining factor 1 (NHEJ1; ook bekend als Cernunnos of XRCC4-like factor ), de onlangs ontdekte paraloog van XRCC4 en XLF (PAXX), en DNA-polymerasen λ en μ. Sommige betrokken enzymen zijn specifiek voor lymfocyten (b.v. RAG, TdT), terwijl andere in andere celtypen en zelfs ubiquitair worden aangetroffen (b.v. NHEJ-componenten).
Om de specificiteit van de recombinatie te handhaven, herkent V(D)J-recombinase en bindt het zich aan recombinatiesignaalsequenties (RSS’s) die de variabele (V), diversiteit (D) en verbindende (J) gensegmenten flankeren. RSS’s bestaan uit drie elementen: een heptamer van zeven geconserveerde nucleotiden, een spacer-regio van 12 of 23 baseparen lang, en een nonamer van negen geconserveerde nucleotiden. Hoewel de meeste RSS’s in sequentie variëren, zijn de consensussequenties van de heptamer en de nonamer respectievelijk CACAGTG en ACAAAAACC; en hoewel de sequentie van de spacer-regio weinig geconserveerd is, is de lengte ervan zeer geconserveerd. De lengte van de spacer-regio komt overeen met ongeveer één (12 baseparen) of twee windingen (23 baseparen) van de DNA-helix. Volgens wat bekend staat als de 12/23 regel, grenzen gensegmenten die gerecombineerd moeten worden gewoonlijk aan RSS van verschillende spacerlengtes (d.w.z. één heeft een “12RSS” en één heeft een “23RSS”). Dit is een belangrijk kenmerk in de regulatie van V(D)J recombinatie.
ProcessEdit
V(D)J recombinatie begint wanneer V(D)J recombinase (door de activiteit van RAG1) een RSS bindt die een coderend gensegment (V, D, of J) flankeert en een enkelstrengs inkeping in het DNA maakt tussen de eerste base van de RSS (net voor de heptamer) en het coderende segment. Dit is in wezen energetisch neutraal (er is geen ATP-hydrolyse nodig) en resulteert in de vorming van een vrije 3′-hydroxylgroep en een 5′-fosfaatgroep op dezelfde streng. De reactieve hydroxylgroep wordt door het recombinase gepositioneerd om de fosfodiësterbinding van de tegenoverliggende streng aan te vallen, waardoor twee DNA-einden worden gevormd: een haarspeld (stam-lus) op het coderende segment en een stomp einde op het signaalsegment. Het huidige model is dat DNA-inkeping en haarspeldvorming gelijktijdig (of bijna gelijktijdig) op beide strengen plaatsvindt in een complex dat bekend staat als een recombinatiecentrum.
De stompe signaaluiteinden worden aan elkaar geligeerd om een cirkelvormig stuk DNA te vormen dat alle tussenliggende sequenties tussen de coderende segmenten bevat, bekend als een signaalverbinding (hoewel cirkelvormig van aard, moet dit niet worden verward met een plasmide). Hoewel oorspronkelijk werd gedacht dat signaalverbindingen tijdens opeenvolgende celdelingen verloren zouden gaan, zijn er aanwijzingen dat signaalverbindingen opnieuw het genoom kunnen binnendringen en tot pathologieën kunnen leiden door oncogenen te activeren of de functie(s) van tumorsuppressorgenen te onderbreken.
De coderende uiteinden worden voorafgaand aan hun binding verder verwerkt door verschillende gebeurtenissen die uiteindelijk tot junctionele diversiteit leiden. De verwerking begint wanneer DNA-PK zich aan elk gebroken DNA-uiteinde bindt en verschillende andere eiwitten rekruteert, waaronder Artemis, XRCC4, DNA-ligase IV, Cernunnos, en verschillende DNA-polymerasen. DNA-PK vormt een complex dat leidt tot zijn autofosforylering, wat resulteert in activering van Artemis. De haarspelden aan het coderende uiteinde worden geopend door de activiteit van Artemis. Als ze in het midden worden geopend, ontstaat een stomp DNA-einde; maar in veel gevallen is de opening “off-center” en blijven er extra basen achter op één streng (een overhang). Deze staan bekend als palindromische (P) nucleotiden vanwege de palindromische aard van de sequentie die ontstaat wanneer DNA-reparatie-enzymen de overhang oplossen. Het proces van haarspeld-opening door Artemis is een cruciale stap van V(D)J recombinatie en is defect in het severe combined immunodeficiency (scid) muismodel.
Volgende, XRCC4, Cernunnos, en DNA-PK lijnen de DNA-uiteinden uit en rekruteren terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), een template-onafhankelijk DNA-polymerase dat niet-templated (N) nucleotiden toevoegt aan het coderende uiteinde. De toevoeging is meestal willekeurig, maar TdT vertoont een voorkeur voor G/C-nucleotiden. Zoals bij alle bekende DNA-polymerasen voegt TdT nucleotiden aan één streng toe in een 5′ tot 3′ richting.
Ten slotte kunnen exonucleasen basen verwijderen van de coderende uiteinden (inclusief eventueel gevormde P- of N-nucleotiden). DNA-polymerasen λ en μ voegen dan extra nucleotiden in als dat nodig is om de twee uiteinden compatibel te maken voor verbinding. Dit is een stochastisch proces, zodat elke combinatie van toevoeging van P- en N-nucleotiden en exonucleolytische verwijdering kan plaatsvinden (of helemaal geen). Tenslotte worden de verwerkte coderende uiteinden aan elkaar geligeerd door DNA-ligase IV.
Al deze verwerkingsevents resulteren in een paratoop die zeer variabel is, zelfs wanneer dezelfde gensegmenten worden gerecombineerd. V(D)J recombinatie maakt het mogelijk immunoglobulines en T cel receptoren te genereren voor antigenen die noch het organisme noch zijn voorouder(s) eerder hoeven te zijn tegengekomen, waardoor een adaptieve immuunrespons mogelijk is op nieuwe ziekteverwekkers die zich ontwikkelen of op die welke vaak veranderen (b.v. seizoensgriep). Een belangrijk voorbehoud bij dit proces is echter dat de DNA-sequentie binnen het kader moet blijven om de juiste aminozuursequentie in het uiteindelijke eiwitproduct te behouden. Als de resulterende sequentie buiten het kader valt, zal de ontwikkeling van de cel worden stopgezet en zal de cel niet tot volle wasdom komen. V(D)J recombinatie is daarom een zeer kostbaar proces dat strikt moet worden gereguleerd en gecontroleerd (en dat ook gebeurt).