Verbetering van de oplosbaarheid van recombinante eiwitten met behulp van de MBP-tag

Hulpbronnen “Technische hulpmiddelen “Eiwit-technische hulpmiddelen “Technische Opmerkingen “MBP-tag

E. coli-expressie

Het genereren van recombinant eiwit vereist het gebruik van een expressiegastheer en E. coli is hiervoor gewoonlijk de eerste keuze. De combinatie van eenvoudige genetica, gemak bij het kweken, snelle expressie en hoge opbrengsten maakt het een aantrekkelijke gastheer, terwijl het ontbreken van een efficiënte post translationele machinerie, een vertekend codongebruik en de moeilijkheid om eiwitten met een hoger molecuulgewicht te produceren, hem nadelig maakt. Een van de grootste kwaden bij E.coli-expressie is echter onoplosbare expressie – het verschijnsel waarbij recombinante overexpressie leidt tot de vorming van onoplosbare eiwitaggregaten, inclusielichamen genaamd.

manieren om met inclusielichamen om te gaan en de oplosbaarheid van doeleiwitten te verbeteren

Wanneer zich inclusielichamen vormen, proberen wetenschappers gewoonlijk een omslachtig proces dat in vitro eiwitoplosbaarheid en -vouwing wordt genoemd om oplosbaar eiwit terug te krijgen, of ze proberen expressieoptimalisatie op proces- of moleculair niveau om onoplosbaarheidsproblemen te voorkomen.

Voorbeelden van optimalisatie op procesniveau omvatten methoden die geen target engineering vereisen. Bijvoorbeeld optimalisering van de expressievoorwaarden, aanpassing van de groei- en inductievoorwaarden, wijziging van media, buffers enz. Een alternatief zou zijn om een moleculaire benadering uit te proberen en het doeleiwit te manipuleren door ongewenste elementen in zijn sequentie te elimineren door truncaties te creëren of bepaalde aminozuren te muteren om het eiwit beter oplosbaar te maken. U zou ook een rationele, gerichte mutagenese-benadering kunnen volgen op basis van structuurinformatie of een gerichte evolutie-benadering en de oplosbaarheid van willekeurige puntmutanten, deleties en fragmenten kunnen onderzoeken. Een betere, gemakkelijkere aanpak zou zijn een fusiepartnerstrategie te volgen en een stroomopwaartse fusiepartner te gebruiken die het doeleiwit beter oplosbaar zou maken.

Fusiepartneraanpak om de oplosbaarheid van eiwitten te verbeteren

Bij deze aanpak wordt een moeilijk tot expressie te brengen eiwit of peptide gefuseerd met een ander, stabiel, goed oplosbaar eiwit om de expressie te stabiliseren, met het idee dat het fusie-eiwit de resulterende expressie zal aansturen. Hoewel veel eiwitten goed oplosbaar zijn, zijn ze niet allemaal effectief als eiwitoplosbaarheidsverbeteraars. In dit opzicht kan Maltose Binding Protein een zeer nuttige partner zijn voor de oplosbaarheid van eiwitten. In een vergelijkende studie, gericht op het onderzoeken van hun eiwitoplosbaarheidsverhogende eigenschappen, bleek E. coli MBP tag een veel effectievere eiwitoplosbaarheidspartner te zijn dan de Glutathione-S-transferase (GST) en Thioredoxine (TRx) eiwitten.

Figuur 1: Aanbeveling van GenScript-wetenschappers betreffende constructontwerp

Over de MBP-tag en zijn werkingsmechanisme

MBP is een ongeveer 42 kDa, natuurlijk voorkomend eiwit in E. coli, gecodeerd door het malE-gen, dat verantwoordelijk is voor de opname, afbraak en transport van maltodextrine, een koolhydraat. Het werd oorspronkelijk in de jaren tachtig ontwikkeld als een eiwitexpressietag en het is bekend dat het de oplosbaarheid van een verscheidenheid van downstream-gefuseerde doeleiwitten aanzienlijk verbetert. Hoewel het exacte mechanisme van de verbetering van de oplosbaarheid van eiwitten door de MBP-tag onduidelijk is, is bekend dat de tag zijn passagierseiwit stabiliseert en beschermt tegen proteolytische degradatie tijdens en na de eiwitsynthese. Cytoplasmatische opbrengsten van MBP-gefuseerde eiwitten zijn meestal ook hoger omdat het fusie-eiwit betrouwbare contexten biedt voor efficiënte translatie-initiatie. Er wordt ook voorgesteld dat de MBP-tag zou kunnen fungeren als een chaperon door interacties via een oplosmiddel blootgestelde hot spot op zijn oppervlak dat stabiliseert de anders onoplosbare passagier eiwit.

Het gebruik van MBP-tag

Hoewel MBP tag gesmolten aan de N- of C-terminus is aangetoond dat de recombinant oplosbare expressie te verhogen, een gemeenschappelijke aanpak is om het te fuseren aan de N-terminus. Aangezien helaas geen enkele tag ideaal kan zijn voor alle toepassingen, zijn er, om de veelzijdigheid van tags en downstream-toepassingen te vergroten, combinatorische-tagging-methoden ontwikkeld voor uiteenlopende behoeften. Twee affiniteitstags die in tandem worden aangebracht, samen met een protease-splitsingsplaats die voorafgaat aan het doeleiwit, maken het gebruik van meerdere zuiveringsstrategieën mogelijk. Door een oplosbaarheidsbevorderende tag in combinatie met een zuiveringstag in te bouwen, worden verbeteringen in de oplosbaarheid van eiwitten en het expressierendement alsmede methoden voor een efficiënte zuivering bereikt

Figuur 2: Een algemeen schema voor constructontwerpstrategie – combinatie van affiniteit/oplosbaarheidstag aan de N-terminus, proteolytische splitsingsplaats gevolgd door het doeleiwit kan goede resultaten geven, vooral voor onoplosbare doeleiwitten. Een linker-sequentie kan vaak helpen bij problemen met proteolytische splitsing.

Purificatie van MBP-tagged eiwitten

Anders dan eiwit oplosbaarheid-verbetering, een ander voordeel van het gebruik van een MBP-fusie strategie is het vergemakkelijken van de zuivering van de downstream doeleiwit. MBP is een natuurlijke affiniteitstag die zich bindt aan amylosehars en het kan worden gebruikt voor eenstapsaffiniteitszuivering door binding aan cross-linked amylose. MBP tag-gefuseerde recombinante eiwitten gebonden aan geïmmobiliseerde amylose worden meestal geëlueerd onder niet-denaturerende omstandigheden met behulp van maltose .

Nadelen van deze strategie

• Splitsing van het doeleiwit kan een probleem zijn door sterische hinder van het MBP-tag
• De amylosehars kan kwetsbaar en relatief duur zijn
• Neerval van het doeleiwit na splitsing
• Sommige MBP-fusie-eiwitten binden zich niet efficiënt aan de amylosehars en zelfs als ze dat wel doen, kan de opbrengst een probleem zijn

Conclusie

Terwijl er geen eenvoudige, globale oplossing is om de onoplosbaarheidsproblemen in E.coli-expressie, kan een goed ontworpen constructie en zorgvuldig ontworpen expressiestrategie u het gewenste oplosbare eiwit geven. MBP is een betrouwbaar oplosbaarheidslabel voor de productie van recombinante oplosbare eiwitten en hoewel oplosbaarheid een van de belangrijkste elementen is van een eiwitproductiecampagne, moet het einddoel niet altijd om de oplosbaarheid draaien. Expressieniveaus, eiwitactiviteit, zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit zijn allemaal belangrijke factoren die ook in overweging moeten worden genomen voordat aan een recombinante eiwitproductiecampagne wordt begonnen.

Weinig publicaties die het nut van de MBP-tag aantonen

Productie van Fusokines met behulp van MBP -Maltose-Binding Protein Fusion maakt Bacteriële Expressie op hoog niveau en Zuivering van Bioactieve Zoogdier Cytokine Derivaten mogelijk (September 2014)

Het redden van aggregatie-vatbare eiwitten met behulp van MBP -Rescuing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (May 2014)

MBP for soluble protein production in E. coli -Hexahistidine-tagged maltose-bindend eiwit als fusiepartner voor de productie van oplosbare recombinante eiwitten in Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A., en Leiting, B. (1997). High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His6-tag and maltose binding protein double-affinity fusion system. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. and Waugh, D. S. (2002). Differential effects of supplementary affinity tags on the solubility of MBP fusion proteins. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., and Waugh, D. S. (2005) Gateway vectors for the production of combinatorially tagged His6-MBP fusion proteins in the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategies to maximize heterologous protein expression in Escherichia coli with minimal cost. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Expression and purification of the first nucleotide-binding domain and linker region of human multidrug resistance gene product: comparison of fusions to glutathione S-transferase, thioredoxin and maltose-binding protein. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci 2001, 10:622-630

Planning op een Bacteriële Expressie project? Vraag binnen enkele seconden een gratis offerte aan voor onze BacPower™ Gegarandeerde proteïne-expressiepakketten.

Quotations and Ordering

#Automatische offerte wordt alleen gegenereerd als sequenties in aanmerking komen voor de Gegarandeerde dienst, zoals bepaald door ons gepatenteerde sequentieanalyseplatform, bij gebreke waarvan onze Technical Account Manager contact met u zal opnemen met een aangepaste offerte voor de productie van eiwitten. Wees ervan verzekerd dat onze aangepaste diensten zijn van dezelfde hoge kwaliteit en concurrerend als onze Guaranteed services.

Onze medewerkers van de klantenservice zijn 24 uur per dag beschikbaar, maandag tot en met vrijdag om u te helpen.