H-D-uitwisseling werd oorspronkelijk gemeten door de vader van de waterstofuitwisseling Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang met behulp van dichtheidsgradiëntbuizen. In de moderne tijd is H-D uitwisseling voornamelijk gecontroleerd met de methoden: NMR-spectroscopie, massaspectrometrie en neutronenkristallografie. Elk van deze methoden heeft zijn voor- en nadelen.
NMR-spectroscopieEdit
Waterstof- en deuteriumkernen zijn sterk verschillend in hun magnetische eigenschappen. Het is dus mogelijk om ze met NMR-spectroscopie van elkaar te onderscheiden. Deuteronen zullen niet worden waargenomen in een 1H NMR spectrum en omgekeerd zullen protonen niet worden waargenomen in een 2H NMR spectrum. Wanneer kleine signalen worden waargenomen in een 1H NMR-spectrum van een sterk gedeutereerd monster, worden deze restsignalen genoemd. Zij kunnen worden gebruikt om de mate van deuterisatie in een molecuul te berekenen. Analoge signalen worden niet waargenomen in 2H NMR spectra vanwege de lage gevoeligheid van deze techniek in vergelijking met de 1H analyse. Deuteronen vertonen doorgaans zeer vergelijkbare chemische verschuivingen als hun analoge protonen. Analyse via 13C NMR spectroscopie is ook mogelijk: de verschillende spinwaarden van waterstof (1/2) en deuterium (1) geven aanleiding tot verschillende splijtingsmultipliciteiten. NMR-spectroscopie kan worden gebruikt om de plaats-specifieke deuteratie van moleculen te bepalen.
Een andere methode maakt gebruik van HSQC-spectra. Gewoonlijk worden HSQC-spectra opgenomen op een aantal tijdstippen terwijl de waterstof wordt uitgewisseld met het deuterium. Aangezien het HSQC-experiment specifiek is voor waterstof, zal het signaal exponentieel afnemen naarmate de waterstof wordt uitgewisseld. Het is dan mogelijk om een exponentiële functie op de gegevens te passen en de uitwisselingsconstante te verkrijgen. Deze methode geeft residu-specifieke informatie voor alle residuen in het eiwit tegelijk Het grote nadeel is dat een voorafgaande toewijzing van het spectrum voor het eiwit in kwestie nodig is. Dit kan zeer arbeidsintensief zijn, en beperkt de methode meestal tot eiwitten kleiner dan 25 kDa. Omdat het opnemen van een HSQC-spectrum minuten tot uren duurt, moeten amiden die snel uitwisselen met andere pulssequenties worden gemeten.
MassaspectrometrieEdit
Waterstof-deuterium-uitwisseling massaspectrometrie kan het totale deuteriumgehalte bepalen van moleculen die een H/D-uitwisseling hebben ondergaan. Vanwege de vereiste monstervoorbereiding wordt deze methode doorgaans geacht alleen een nauwkeurige meting van niet-uitwisselbare waterstofatomen te geven. Er kan ook sprake zijn van H/D-uitwisseling in de gasfase of van uitwisseling in de oplossingsfase vóór de ionisatie. Het heeft verschillende voordelen in NMR-spectroscopie met betrekking tot de analyse van H-D uitwisselingsreacties: er is veel minder materiaal nodig, de concentratie van het monster kan zeer laag zijn (zo laag als 0,1 uM), de grootte-limiet is veel groter, en de gegevens kunnen gewoonlijk veel sneller worden verzameld en geïnterpreteerd.
De deuteriumkern is tweemaal zo zwaar als de waterstofkern omdat hij zowel een neutron als een proton bevat. Een molecuul dat wat deuterium bevat, zal dus zwaarder zijn dan een molecuul dat alleen waterstof bevat. Naarmate een eiwit meer deuterium bevat, neemt de moleculaire massa dienovereenkomstig toe. Het detecteren van de verandering in de massa van een eiwit bij deuteratie werd mogelijk door moderne eiwit-massaspectrometrie, voor het eerst gerapporteerd in 1991 door Katta en Chait.
Het bepalen van plaats-specifieke deuteratie via massaspectrometrie is gecompliceerder dan met behulp van NMR-spectroscopie. Bijvoorbeeld, de plaats en de relatieve hoeveelheid van deuterium uitwisseling langs de peptide ruggengraat kan ruwweg worden bepaald door het onderwerpen van het eiwit aan proteolyse nadat de uitwisselingsreactie is gedoofd. Afzonderlijke peptiden worden vervolgens geanalyseerd op de totale deuterisatie van elk peptidefragment. Met deze techniek wordt de resolutie van de deuteriumuitwisseling bepaald door de grootte van de peptiden die tijdens de ontsluiting worden geproduceerd. Pepsine, een zure protease, wordt algemeen gebruikt voor proteolyse, aangezien de quench pH tijdens de proteolytische reactie moet worden gehandhaafd. Om de terugwisseling tot een minimum te beperken, moeten de proteolyse en de daaropvolgende massaspectrometrie-analyse zo snel mogelijk worden uitgevoerd. HPLC-scheiding van de peptische digestie wordt vaak uitgevoerd bij lage temperatuur net vóór de electrospray-massaspectrometrie om de terugwisseling te minimaliseren. Meer recentelijk is UPLC gebruikt vanwege zijn superieure scheidingsmogelijkheden.
In 1999 werd voorgesteld dat het mogelijk zou kunnen zijn om single-residue resolutie te bereiken door gebruik te maken van collision-induced dissociation (CID) fragmentatie van gedutereerde peptiden in combinatie met tandem massaspectrometrie. Al snel werd ontdekt dat CID “scrambling” veroorzaakt van de deuteriumpositie binnen de peptiden. Fragmentatie door MALDI in-source decay (ISD), electron capture dissociation (ECD) en electron transfer dissociation (ETD) verloopt echter onder de juiste experimentele omstandigheden met weinig of geen versplintering. Het vervormen van de isotopische labeling wordt veroorzaakt door botsingsverwarming vóór de dissociatie van het ion en terwijl CID wel vervorming veroorzaakt, kan ook tijdens de ionisatie en het ionentransport botsingsverwarming optreden. Door zorgvuldige optimalisatie van de instrumentparameters die ionenverwarming veroorzaken, kan waterstofverstrooiing echter zodanig worden geminimaliseerd dat de isotopische labeling in de oplossingsfase behouden blijft totdat fragmentatie kan worden uitgevoerd met een techniek waarbij geen verstrooiing optreedt. Meer recentelijk is ook ultraviolette fotodissociatie (UVPD) onderzocht als een mogelijke fragmentatietechniek om deuterium in peptiden en eiwitten te lokaliseren. In dit verband zijn de conclusies gemengd: terwijl het mogelijk is UVPD-fragmenten te verkrijgen die onder bepaalde omstandigheden geen scrambling hebben ondergaan, hebben anderen aangetoond dat scrambling zowel voor peptiden als voor eiwitten kan optreden tijdens de UVPD-fragmentatiestap zelf. De huidige theorie die deze schijnbare tegenstrijdigheden consolideert heeft te maken met de tweeledige fragmentatieroute die kan ontstaan bij UV-bestraling van peptiden en eiwitten, namelijk directe en statistische dissociatie. Dat wil zeggen, als de experimentele omstandigheden directe dissociatie begunstigen en het precursorion voor en tijdens de fragmentatie op lage interne energieën wordt gehouden, zal het deuteriumniveau van de resulterende fragmenten overeenstemmen met de niet-gescrambelde precursor. Experimentele omstandigheden kunnen echter statistische dissociatie tijdens UV-bestraling bevorderen, vooral bij lange bestralingstijden en lage gasdruk, hetgeen leidt tot interne omzetting van de elektronische excitatie-energie die door de UV-fotonen wordt bijgedragen. Het resultaat is vibratie-excitatie van het bestraalde molecuul, dat op zijn beurt een scrambling ondergaat.
NeutronenkristallografieEdit
Wisseling van waterstof-deuterium van snel wisselende soorten (b.v. hydroxylgroepen) kan met neutronenkristallografie bij atomaire resolutie kwantitatief worden gemeten, en in real time indien de uitwisseling tijdens het diffractie-experiment plaatsvindt.
Stevige neutronenbundels worden in het algemeen gegenereerd door spallatie bij linac-deeltjesversnellers zoals de Spallation Neutron Source. Neutronen diffracteren kristallen op dezelfde wijze als röntgenstraling en kunnen worden gebruikt voor structuurbepaling. Waterstofatomen, met één tot nul elektronen in een biologische omgeving, breken röntgenstraling slecht af en zijn in feite onzichtbaar onder normale experimentele omstandigheden. Neutronen verstrooien van atoomkernen en kunnen derhalve waterstof- en deuteriumatomen detecteren.
Hydrogeenatomen worden routinematig vervangen door deuterium, waardoor een sterke en positieve verstrooiingsfactor wordt geïntroduceerd. Het is vaak voldoende om alleen de oplosmiddel- en labiele waterstofatomen in een proteïnekristal door dampdiffusie te vervangen. In een dergelijke structuur zal de bezetting van een uitwisselbaar deuteriumatoom in een kristal zich verfijnen van 0-100%, waardoor de mate van uitwisseling direct kan worden gekwantificeerd.