Zuivering van enkelstrengs DNA door co-polymerisatie met acrylamide en elektroforese

Enkelstrengs DNA (ssDNA) is nuttig voor aptameren (1), zelfassemblage (2), DNA origami (3), DNA circuits (4), hybridisatie sondes (5), en DNA robotica (6). Chemisch gesynthetiseerd DNA is standaard enkelstrengs.

Hier presenteren we een methode om ssDNA te produceren uit een PCR-product. Het gebruik van een PCR-product in plaats van synthetisch DNA kan voordelig zijn omdat PCR introduceert minder mutaties dan chemische synthese en kan genereren DNA’s langer dan de ∼120 base limiet voor chemische synthese. Uitgaande van een klonaal monster kunnen PCR-producten ook een aanzienlijk hogere sequentiezuiverheid hebben dan chemisch gesynthetiseerd DNA. Hoge sequentie zuiverheid is van cruciaal belang voor hoge prestaties in DNA-circuit technologie (7).

Onze single-strand generatie (SSG) methode is schaalbaar en vereist slechts één zuiveringsstap. Deze verwijdert de ongewenste complementaire streng en voert op grootte gebaseerde zuivering uit van residuele primer en ongewenste PCR-producten. SSG door co-polymerisatie en elektroforese kan worden toegepast op het product van geavanceerde PCR-protocollen zoals Gibson-assemblage (8) om lange, enkelstrengs producten met een willekeurige sequentie te maken. Dit kan van nut zijn voor DNA origami en andere zelfassemblage toepassingen.

SSG maakt gebruik van een in de handel verkrijgbare DNA modificatie bekend als een acrydiet. Deze modificatie voegt een polymeriseerbare vinylgroep toe, die in een groeiende acrylamidepolymeerketen wordt opgenomen (9). Acrydiet gemodificeerd DNA is gebruikt voor een aantal toepassingen, waaronder een schakelbare hydrogel (10), het vastleggen van kwik (11) of PDGF (12), en voor het wijzigen van de snelheid van elektroforese van specifieke sequenties (13). Onze techniek is oppervlakkig vergelijkbaar met de methode waarmee de Church-groep polymerase-koloniën immobiliseerde binnen dunne polyacrylamide-gels. De acrydite is van cruciaal belang voor de vorming van klonale PCR-producten (polonies) in sommige vormen van DNA-sequencing (14).

In gevallen waarin aanzienlijke hoeveelheden zuiver ssDNA nodig zijn, onze aanpak met behulp van acrydite gemodificeerde primers en polyacrylamide immobilisatie is een lonende optie. We tonen ook aan dat deze techniek kan SSG, grootte scheiding, en elektro-elutie te integreren in een enkele stap.

Materialen en methoden

Niet anders vermeld, werden reagentia verkregen van Sigma Aldrich (St. Louis, MO) en gebruikt zonder verdere zuivering. DNA werd verkregen van IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) en gebruikt zonder verdere zuivering (voor sequentie informatie, zie aanvullende tabel S1).

Demonstratie van capture van acrydite streng

Voor de eerste demonstratie van SSG door co-polymerisatie met acrylamide en vervolgens elektroforese, we gewijzigd een primer met acrydiet en Cy5 rood fluorescerende kleurstof. De andere primer werd gekocht met een groen fluorescerende 5′ fluoresceïnemodificatie. Figuur 1 toont hoe het DNA-monster werd bereid door het mengen van 100 pi 10% denaturerende gel (prepolymeer vóór de initiatie van polymerisatie) met 100 pi PCR-product (∼20 pMol product) en de juiste massa droog ureum (5% eindconcentratie acrylamide, 7 M eindconcentratie ureum). Het DNA/prepolymeer werd in een droog putje van een denaturerende PAGE-gel van 5% geladen. De gel werd verwarmd zoals hieronder beschreven, en elektroforese werd uitgevoerd om de groen fluorescerende streng te scheiden van de geïmmobiliseerde rood fluorescerende streng. De resulterende gel werd afgebeeld met behulp van een standaard gel imaging-systeem met LED-verlichting (FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA).

Single-streng generatie en zuivering (verticale gelelektroforese)

PCR werd in alle gevallen uitgevoerd met de Accuprime Pfx-reactiekit (Life Technologies, Grand Island, NY) met 50 nM sjabloon, 10 μM van elke primer, en 8 thermische cycli. Het PCR-product werd gedenatureerd door toevoeging van vast ureum tot een eindconcentratie van 7 M in een reactie van 100 μl. Polyacrylamide werd bereid uit een commercieel verkregen voorraadoplossing van 40% acrylamide in water met een 19:1 verhouding van acrylamide:bis-acrylamide (Bio-Rad, Hercules, CA). Denaturerende polyacrylamide werd bereid met eindconcentraties van 7 M ureum, 20% acrylamide, en 0,25× TBE buffer. Polymerisatie werd geïnitieerd door toevoeging van 1 pi TEMED (N,N,N′,N′-tetramethylethyleendiamine) en 10 pi 10% ammoniumpersulfaat aan een aliquot van 1 ml denaturerend acrylamide prepolymeer. Een deel van dit mengsel (prepolymeer voor het begin van de polymerisatie) werd snel gemengd 1:1 met 100 ul PCR-product (vijf 20-Îl PCR-reacties volgens de instructies van de fabrikant, gepoold) met 7 M ureum (10% acrylamide, eindconcentratie). De PCR / polymeriseren acrylamide mengsel werd toegevoegd aan een droge put in een standaard verticale denaturerende PAGE gel. Volledige polymerisatie van de PCR / denaturerende acrylamide werd gezorgd door spoelen van de ruimte boven de put met een zachte stroom van argon of 99,97% stikstof (om alle zuurstof die de polymerisatie remt verdringen). Na ∼30 min polymerisatie werd de elektroforese-installatie opgesteld. Het breken van de polyacrylamide en het laden van de gemacereerde stukken in de put produceerde een zeer brede, onregelmatig gevormde band, zodat deze aanpak werd afgezien (gegevens niet weergegeven). Polymerisatie in de well was een superieure aanpak. We verwarmden de lopende buffer in een magnetron tot koken en voegden de hete (∼80°C-90°C) buffer toe aan het kathode-reservoir (door de hete buffer over de gevulde putjes te gieten) om het vrijkomen van het DNA uit het putje te bevorderen. De toevoeging van de hete buffer werd voortgezet totdat het gelreservoir vol was tot het voor de elektroforese vereiste volume. De DNA-bevattende gel kwam in direct contact met de hete buffer wanneer spanning werd aangelegd. De hete buffer moet onmiddellijk worden toegepast en mag niet afkoelen. Vervolgens werd de elektroforese uitgevoerd volgens het schema in figuur 1.

SB (5 mM natriumboraat) en TBE-buffers kunnen als loopbuffers worden gebruikt. SB en TBE werden bij RT bereid bij pH 8,42 respectievelijk 8,36. Bij 80°C veranderen deze pH-waarden in respectievelijk 8,21 en 7,47. Deze pH-verandering is van voorbijgaande aard. De gel koelt tijdens de elektroforese af tot 30°C-40°C. Deze verandering in pH veroorzaakte geen merkbare degradatie van het DNA.

Om de scheiding van de twee strengen zichtbaar te maken, gebruikten we primers gemodificeerd met twee verschillende fluoroforen. De mobiele streng werd gegenereerd met behulp van een fluoresceïne-gemodificeerde primer. De primer (acrydiet) voor de immobiele streng werd bereid met een interne Cy5-modificatie. Met behulp van deze twee kleurstoffen konden we de voortgang van de scheiding visualiseren. We scanden deze gel met een gel imager (FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA) na 45 min elektroforese bij 500 V.

Als alternatieve benadering kan het PCR-product worden voorgeconcentreerd door standaard ethanolprecipitatie. De pellet kan vervolgens worden opgelost in een kleiner volume acrylamide prepolymeer. Bij ons werd de verhoogde concentratie in het putje gecompenseerd door verliezen bij het precipiteren. In sommige gevallen (b.v. voor een vage productband) kan deze aanpak de voorkeur verdienen.

De fluorescerende band met het enkelstrengs, met fluoresceïne gemodificeerde product werd van de gel geknipt onder blauwe LED-verlichting bij ∼475 nm (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). Het DNA werd geëlueerd met de standaard “crush and soak”-methode (15). Wanneer het geëlueerde (teruggewonnen) DNA te verdund was voor een efficiënte ethanolprecipitatie, concentreerden we het door extractie met butanol. Het product werd vervolgens neergeslagen met ethanol en verder geanalyseerd zoals hieronder aangegeven.

PAGE-analyse

De fluoresceïne-gelabelde enkelstrengs producten (sDNA vrijgegeven door denaturerende PAGE) werden geanalyseerd op zuiverheid met behulp van natieve PAGE. We resuspendeerden het enkelstrengs product in 10 pl en kwantificeerden het met UV-Vis spectroscopie. We maakten gelijke molaire concentraties van primer en enkelstrengs product en elektroforeerden deze monsters en een 25-bp groen fluorescerende ladder (Jena Bioscience, Jena, Duitsland) op een 15% natieve PAGE gel, die werd gevisualiseerd met de Storm scanner voor het fluoresceïne signaal.

Quencher analyse

Om verder vast te stellen dat het product in feite enkelstrengs was, testten we op de hybridisatie van een complementaire oligonucleotide (quench probe) die een 3′ quencher modificatie bevatte. Wanneer goed gehybridiseerd, plaatst de quench probe een Iowa Black quencher binnen een paar nanometer van de 5′ fluoresceïne modificatie op de complementaire streng. Dit veroorzaakt een sterke afname van de fluorescentie-intensiteit. De quench-probe hybridiseert alleen met ssDNA. Als het product dubbelstrengs is, wordt de hybridisatie geblokkeerd en blijft de fluorescentie onaangetast. In PCR-buisjes werden driemaal 10 µl monsters van 100 nM met fluoresceïne gemodificeerde producten (PCR-product, SSG-product en primercontrole) bereid. Deze werden gemeten met een QuantiFluor fluorometer (Promega, Madison, WI) voor de eerste fluorescentiewaarden, en 1,1 molaire equivalenten van quench probe DNA werden vervolgens toegevoegd, vortexed, gecentrifugeerd, en laat incubeer gedurende ongeveer 1 min. De fluorescentie werd vervolgens geregistreerd om te bepalen of er quenching optrad.

Vergelijking van single-strand generatie technieken voor aptameer productie

Om de effectiviteit van deze methode voor het genereren van functionele aptameren vast te stellen, kochten we een sjabloon voor PCR amplificatie van een bekende aptameer-sequentie die lysozym bindt. We amplificeerden deze template met een fluoresceïne-gemodificeerde primer en een acrydiet-gemodificeerde reverse primer. We voerden het SSG-protocol uit zoals hierboven beschreven. Wij hebben lysozym aan 5,8 μm carboxylaat-gemodificeerde korrels (Bangs Labs, Fishers, IN) geconjugeerd door middel van het standaard EDC-koppelingsprotocol. Deze korrels werden geïncubeerd met het SSG-product, fluorescerend gerandomiseerd DNA (geen sequentieovereenkomst met de aptameer), en een chemisch gesynthetiseerde fluorescerende aptameer van dezelfde sequentie. Als negatieve controle incubeerden we ook ongecoate korrels met de chemisch gesynthetiseerde fluorescerende aptameer. De incubatie duurde 30 min en de korrels werden vervolgens 3 maal gewassen. Flowcytometrie werd op deze deeltjes uitgevoerd met een FACScalibur (BD Bioscience San Jose, CA). De verdeling van de fluorescentie intensiteiten met excitatie door 488-nm licht werd geregistreerd.

Single-strand generatie en zuivering (horizontale gelelektroforese)

Een 7 M ureum denaturerende polyacrylamide gel werd horizontaal gegoten zoals eerder beschreven (16). Kort gezegd, 25 mL prepolymeeroplossing (7 M ureum, 6% acrylamide / bis-acrylamide, SB buffer) werd geïnitieerd met 84 ul APS en 20 ul TEMED. De gel prepolymeer werd gegoten in een horizontale mal. De vorm werd vervolgens in een plastic zak geplaatst, die werd gespoeld met stikstof. De gel mocht polymeriseren gedurende 30 min. Met fluoresceïne gelabeld en met acrydiet gelabeld DNA werden gemengd in 1 M natriumfosfaat bij pH 8,0 en geanneëerd door de temperatuur te verhogen tot 80 °C en langzaam af te koelen bij 0,1 °C per seconde tot RT. Het mengsel werd langzaam afgekoeld om intermoleculaire hybridisatie tussen twee strengen te bevorderen. De prepolymeer mengsel (2,5 mL) werd geïnitieerd door toevoeging van 8,4 pi APS en 2 pi TEMED. Eenmaal gemengd, 20 ul van deze oplossing werden toegevoegd aan de 5 pi DNA-oplossing. Dit werd vervolgens overgebracht naar een droog putje in de polyacrylamidegel. Om vervorming van de elektrische veldlijnen te voorkomen, werden de resterende putjes gevuld met niet-DNA-bevattend acrylamide. De geladen gel werd in een plastic zak gedaan en gespoeld met stikstof. De gel werd gedurende 10 min. op 10 V/cm gehouden. Vervolgens werd de gel belicht met een blauwe LED-transilluminator en een digitale camera. Om het ssDNA uit de verknoopte gel in het putje los te maken, werd 25 ml SB-buffer in een magnetron aan de kook gebracht. Deze hete buffer werd vervolgens over de gel gegoten. De elektroforese werd voortgezet bij 10 V/cm gedurende 10 min. De gel werd ter vergelijking opnieuw belicht zoals hierboven beschreven.

Initiële associatie tussen het met fluoresceïne en acrydiet gemerkte DNA werd bevorderd met behulp van 1 M natriumfosfaatbuffer. Als het DNA alleen door hybridisatie bij elkaar zou worden gehouden, zou 7 M ureum en de uitwisseling van buffer in 5 mM SB-buffer tijdens de elektroforese voldoende zijn om het DNA in de gel vrij te maken. In plaats daarvan was warmte nodig. Dit toonde aan dat de mobiele DNA-streng geassocieerd of verstrikt is met de gel in plaats van met zijn complementaire DNA-streng.

Resultaten en discussie

Acrydiet gemodificeerd DNA is immobiel onder elektroforese

Van de twee strengen van het dsDNA PCR-product zit de acrydietstreng gevangen in het co-polymeer, terwijl de complementaire streng mobiel is. Om dit aan te tonen, werd PCR uitgevoerd met één primer gemodificeerd met zowel acrydiet als een rode fluorescerende kleurstof (Cy5). De omgekeerde primer werd gemodificeerd met fluoresceïne. Het PCR-product werd gepolymeriseerd in een denaturerende PAGE-gel (5%). Een schematisch diagram van het proces is weergegeven in figuur 1. Aanvankelijk zijn zowel de groen fluorescerende als de rood fluorescerende strengen geco-lokaliseerd (geel gekleurde gel). Bij toepassing van spanning migreert alleen het met fluoresceïne gelabelde product (groen) in de gel. De acrydiet en Cy5 co-gelabelde streng (rood) wordt gefixeerd in het uiteindelijke gelbeeld (figuur 1B). Bovendien is de residuele primer van de PCR-reactie duidelijk zichtbaar als een tweede groene band. Na elektroforese, kan de zuivere, enkelstrengs product worden gesneden en geëlueerd per standaard gel zuivering protocollen.

Single-stranded DNA verificatie

We geïsoleerd enkelstrengs, fluoresceïne gemodificeerde DNA door het snijden en elueren van de band van belang. Om aan te tonen dat het met deze methode verkregen product enkelstrengs is, hebben we twee verschillende methoden gebruikt. De eerste methode was natieve gelanalyse. Figuur 2A toont een beeld van een natieve gel met de primer, PCR-product (dsDNA), en ssDNA gezuiverd door deze methode. De natieve gel vertoont een duidelijke scheiding tussen het dsDNA en het ssDNA. Na SSG met de acrydietprimer (gevolgd door snijden van de gel en elutie van het product) is het meeste geïsoleerde DNA enkelstrengs.

We bevestigden dit resultaat met behulp van een quencher-gemodificeerde hybridisatieprobe (figuur 2B). De probe was ontworpen om een quencher in de nabijheid van het fluoresceïne-gedeelte op het ssDNA-product te brengen. Bij hybridisatie vermindert de quenchermolecule de fluorescentie-intensiteit met ∼90%. Aangezien de probe alleen hybridiseert met ssDNA, toont dit experiment aan dat het met fluoresceïne gemodificeerde product enkelstrengs was. Als negatieve controle hebben we ook het dsDNA PCR-product getest. Het dubbelstrengs PCR-product was niet in staat om te hybridiseren met de quencher probe; daarom bleef de fluorescentie vrijwel onveranderd.

Aptameren gesynthetiseerd door PCR gezuiverd door co-polymerisatie en elektroforese

Hoog zuiver ssDNA wordt geproduceerd door onze SSG-techniek. We hebben ssDNA aptameerproducten van PCR gezuiverd met behulp van twee methoden: (i) SSG door co-polymerisatie en elektroforese en (ii) een biotine-avidine immobilisatie techniek elders beschreven (d.w.z. Polysciences Technisch informatieblad 753) (17,18). Single-stranded aptamers werden ook gegenereerd door chemische synthese. Figuur 3A toont ssDNA aptameren gegenereerd met behulp van de drie verschillende methoden. Rij 1 is een marker ladder voor grootte vergelijking. Rij 2 toont het gezuiverde ssDNA gegenereerd door PCR met een acrydiet primer gevolgd door co-polymerisatie met acrylamide, elektroforese, en gel zuivering. Slechts één band met de juiste grootte voor ssDNA is zichtbaar. Rij 3 is het ssDNA dat is gegenereerd door PCR met een gebiotinyleerde primer, gevolgd door zuivering met avidine-gecoate magnetische korrels. Rij 4 is chemisch gesynthetiseerd DNA met dezelfde sequentie. Gezuiverde ssDNA aptameren van SSG door co-polymerisatie en elektroforese toonden een hoge ssDNA zuiverheid.

We wilden vervolgens testen of deze procedure functionele aptameren oplevert. Daartoe genereerden we een eerder beschreven aptameer tegen lysozym met behulp van PCR met aangepaste primers. De “Clone 1” anti-lysozyme aptameer werd voor het eerst geproduceerd in het Ellington laboratorium en was oorspronkelijk geselecteerd als een RNA aptameer (19); andere groepen hebben gemeld dat de DNA-sequentie ook als een aptameer werkt (20,21). Wij vonden dat zowel PCR als chemische DNA synthese een functionele aptameer produceerde. Op basis van deze en andere experimenten concluderen wij dat dit een van de weinige uitzonderlijke gevallen is waarin zowel RNA als de DNA-sequentie het doelwit bindt. Dit is een vreemd en toevallig resultaat; de meeste aptameren functioneren niet wanneer zij rechtstreeks naar een andere chemie worden vertaald. Deze resultaten bevestigen de vele gevallen in de literatuur die erop wijzen dat de Clone 1 anti-lysozyme aptamer een speciaal geval is.

Flow cytometry analyse toonde ook aan dat de SSG-gezuiverde ssDNA aptamer functioneel is. Figuur 4B toont lysozym-gecoate kralen blootgesteld aan willekeurig DNA, de chemisch gesynthetiseerde aptameer tegen lysozym, of onze SSG-zuivere aptameer tegen lysozym. Zowel de SSG-zuivere als de chemisch gesynthetiseerde aptameren vertoonden een sterke binding aan de met lysozym gecoate korrels, terwijl het willekeurige DNA geen significante binding aan de lysozymkorrels vertoonde. Dit wijst erop dat deze interacties specifiek zijn voor de aptameersequentie. Ongecoate korrels vertonen geen fluorescentie met of zonder de aptameer, wat erop wijst dat de binding specifiek voor het eiwit is.

Verhitting releases DNA uit putjes

Bij het zuiveren van ssDNA aptamers van het PCR-product met behulp van de SSG-methode, was het noodzakelijk om de gel te verhitten om DNA-elektroforese te vergemakkelijken (zie “Materials and methods”). Om te begrijpen waarom dit nodig was, gebruikten we horizontale PAGE. Zonder de toepassing van warmte werd het gewenste ssDNA PCR-product in het putje vastgehouden, ondanks het gebruik van 7 M ureum en de spanningsgradiënt.

Onze eerste hypothese was dat deze retentie te wijten was aan de 80 bp hybridisatie in het PCR-product. Om deze theorie te testen, verminderden wij de complementariteit tot 23 bp door het fluoresceïne-gelabelde Clone 1 aptameer-DNA (aangeduid met F-Aptamer in figuur 4) aan een 23-nucleotide lange acrydiet-gemodificeerde primer (aangeduid met AC-Clone1-P2 in figuur 4) te anneëren en voerden SSG door co-polymerisatie en elektroforese uit. Ondanks de relatief korte 23 bp hybridisatie, werden significante hoeveelheden van het aptameer-DNA in de well behouden (figuur 4A, onderste lane). Dit gaf aan dat onze hypothese onjuist was, omdat de kortere hybridisatiestrook van 23 bp, die gemakkelijk in 7 M ureum gedenatureerd zou moeten worden, niet toeliet dat de gewenste ssDNA-streng uit het putje vrijkwam.

We testten vervolgens de hypothese dat retentie van de lengte afhankelijk was. Hier, we anneed een 5′-acrydiet gemodificeerde 19-nucleotide lange oligonucleotide (aangeduid als AC-DNA in figuur 4) naar een 19-nucleotide volledig complementaire, fluoresceïne-gelabelde oligonucleotide (aangeduid als F-DNA * in figuur 4). Ondanks de vergelijkbare hybridisatielengte werd het korte DNA gemakkelijk gezuiverd van zijn complement in een denaturerende gel zonder toepassing van warmte. Vrijwel alle 19-nucleotide, fluoresceïne-gelabelde mobiele streng komt in de gel (figuur 4A, middelste rijstrook). Om aan te tonen dat de met acrydiet gemodificeerde 19-mer werd behouden, werd een streng die zowel met fluoresceïne als met acrydiet was gemodificeerd (in figuur 4 aangeduid met AC-DNA-F) ook in het putje geco-polymeriseerd (bovenste rijstrook) en werd met succes behouden. (zie “Materials and methods” en aanvullende tabel S1 voor sequentie en nomenclatuur details)

Na de eerste 20 min van elektroforese (zonder verwarming), was het duidelijk dat veel van de Clone 1 aptamer DNA was niet mobiel (ondanks een korte hybridisatie lengte). Om het aptameer-DNA van het polyacrylamide los te maken, was het nodig de gel te verwarmen. We verwarmden de loopbuffer tot bijna kokend in een magnetron en goten deze vervolgens over de gel in de buurt van de putjes. De elektroforese werd vervolgens nog eens 20 minuten voortgezet (figuur 4B, onderste rijstrook), en de aptameerband werd dan mobiel. Deze nieuwe band had dezelfde mobiliteit als de oorspronkelijke mobiele band, wat aangeeft dat dit dezelfde aptameer soort. Evenzo was dit hetzelfde monster van DNA dat slechts een enkele band in figuur 3A opgeleverd. Dit experiment toont de noodzaak aan van verhitting van de gel om al het lange ssDNA uit het polyacrylamide vrij te maken. Het behoud van DNA in de put is niet te wijten aan hybridisatie, maar waarschijnlijk aan verstrengeling in de polyacrylamidematrix.

Horizontale PAGE voor single-strand generatie en geïntegreerde elektro-elutie

Gebruik van een horizontale gel maakt het mogelijk elektro-elutie worden uitgevoerd in plaats van snijden en extraheren van het product band. Het gebruik van een tweede extractie kam voor extra putjes voor elektro-elutie en extractie in horizontale PAGE maakte SSG en elektro-elutie van DNA sneller. We gebruikten Inkscape software om een aparte kam voor elektro-elutie die was dieper en breder dan de lading kam ontwerpen (zie Aanvullend materiaal voor de sjabloon gebruikt om de kammen snijden). Het ontwerp werd lasergesneden in acryl met een CO2-lasersnijder (zie figuur 5, A en B).

Typisch wordt PAGE uitgevoerd met een verticale gel tussen glazen platen. Om een horizontale PAGE-gel te gieten, moest zuurstof tijdens de polymerisatie worden uitgesloten. Wij voerden de polymerisatie uit in een zak gevuld met stikstofgas (of argon) om zuurstof uit te sluiten. De gel werd gegoten met de twee kammen, en elektroforese werd uitgevoerd volgens de standaard horizontale gel elektroforese procedures.

Figuur 5C toont een horizontale gel voor SSG door co-polymerisatie en elektroforese met elektro-elutie. Lanen 1-4 (van boven) bevatten een aptameerpool. Rij 5 is leeg gelaten om onbedoelde kruisbesmetting te voorkomen; primer standaard in rij 6 was aanwezig om de ongewenste band te onderscheiden. De pool werd geamplificeerd met een acrydiet-gemodificeerde primer en een met fluoresceïne gelabelde primer. De met acrydiet gemodificeerde streng werd in het putje vastgehouden. Het met fluoresceïne gelabelde product is duidelijk zichtbaar onder blauwe LED-verlichting. We lieten de primer door de extractieputjes lopen en aan de andere kant van de gel weer naar buiten (zie figuur 5D). De productbanden konden vervolgens onder een blauwlichttransilluminator in real time worden geobserveerd bij het naderen van de extractieputjes. Wanneer de productbanden de putjes binnengingen, werden zij met een pipet opgezogen. Dit proces duurde ongeveer 1 uur. Precipitatie en recuperatie verliepen vervolgens volgens de gepubliceerde aptameer-selectieprotocollen. Dit elimineerde de noodzaak voor een aparte streng-scheidingsstap of een nacht extractie van de gel.

Er zijn verschillende methoden voor het isoleren van ssDNA uit dsDNA. Methoden voor het zuiveren van ssDNA uit PCR-producten omvatten: geïnduceerde mobiliteit verschuiving (22), biotine-avidine kraal immobilisatie (18), selectieve digestie met een DNase (23), en asymmetrische toevoeging van PCR primers (24). Deze methoden verschillen qua kosten, zuiverheid en schaalbaarheid. Een geïnduceerde mobiliteitsverschuiving (22) in één primer kan problemen bij de amplificatie veroorzaken (zo kunnen met PEG gemodificeerde primers bij PCR minder goed presteren), en enzymatische digestie met een DNase (23) of chemische breuk van één streng zal onzuiverheden achterlaten (en een nieuwe stap in het totale proces introduceren). Asymmetrische toevoeging van PCR-primers (24) zal een aanzienlijke hoeveelheid dsDNA in het product achterlaten en is zeer vatbaar voor amplificatiefouten. De meest populaire methode is het extraheren van de ongewenste, gebiotinyleerde streng met behulp van avidine-gecoate microbolletjes (18). Deze methode heeft verschillende valkuilen. Niet-gereageerde primer bezet de avidineplaatsen op de korrels en de biotine-avidine-interactie wordt afgebroken bij de smelttemperatuur van lang dubbelstrengs DNA (25). Dit draagt bij tot aanzienlijke dsDNA-onzuiverheden. Methoden op basis van korrels hebben aanzienlijke kosten: 1,80 $/nMol voor avidinekorrels plus 0,50 $/nMol voor de biotineprimer. Voor SSG door co-polymerisatie en elektroforese is alleen acrydietprimer nodig, die $0,80 per nMol kost. Polyacrylamide is zeer goedkoop en schaalbaar. Elektroforetische mobiliteit is een tweede dimensie van zuivering die inherent is aan de techniek. Zowel de acrydiet gemodificeerde streng als de overgebleven primer worden in één stap uit de PCR-reactie verwijderd.

We hebben aangetoond dat SSG kan worden gebruikt om een functionele aptameer te zuiveren. De techniek zou ook kunnen worden gebruikt voor het zuiveren van een ssDNA-pool in de loop van de selectie van DNA-apptameren. Bovendien kan SSG ook toepassing vinden voor het genereren van ssDNA voor affiniteitssondes of backbones voor DNA origami (3). Het is belangrijk op te merken dat in vergelijking met chemische synthese, PCR productie van DNA heeft een veel hogere sequentie trouw, die van cruciaal belang is voor toepassingen zoals DNA computation/DNA circuits (26).