Biofizicianul Adam Cohen se plimba prin San Francisco, California, în 2010, când un apel telefonic l-a luat prin surprindere. „Avem un semnal”, a spus interlocutorul. La aproape 5.000 de kilometri distanță, în Cambridge, Massachusetts, colaboratorii săi dăduseră lovitura. După luni de experimente eșuate, cercetătorii găsiseră o proteină fluorescentă care le permitea să urmărească semnalele în timp ce treceau între neuroni.
Dar se întâmpla ceva ciudat. Când Cohen s-a întors în laboratorul său de la Universitatea Harvard, a aflat că toate înregistrările experimentului arătau o progresie ciudată. La început, neuronii decorați cu proteina sclipeau frumos în timp ce impulsurile electrice treceau prin ei. Dar apoi celulele s-au transformat în pete luminoase. „La jumătatea fiecărei înregistrări, semnalul devenea complet sălbatic”, spune Cohen.
Așa că a decis să se alăture echipei sale în timpul unui experiment. „Când începeau înregistrarea, ei stăteau acolo ținându-și respirația”, spune Cohen. Dar imediat ce își dădeau seama că funcționează, sărbătoreau, „dansând și alergând prin cameră”.
În exuberanța lor, lăsau lumina de la o lampă de birou să lumineze direct pe microscop. „De fapt, ne înregistram entuziasmul”, spune Daniel Hochbaum, pe atunci student absolvent în grupul lui Cohen. Ei și-au mai domolit sărbătorile și, un an mai târziu, echipa și-a publicat studiul1 – unul dintre primele care au arătat că o proteină fluorescentă proiectată în neuroni specifici de mamifere poate fi folosită pentru a urmări impulsurile electrice individuale în timp real.
Neurostiintificii au încercat timp de decenii să observe semnalele electrice rapide care sunt o componentă majoră a limbajului creierului. Deși electrozii, calul de bătaie pentru măsurarea tensiunii, pot înregistra în mod fiabil activitatea neuronilor individuali, ei se străduiesc să capteze semnalele mai multor neuroni, în special pentru perioade prelungite. Dar, în ultimele două decenii, oamenii de știință au găsit o modalitate de a încorpora proteine fluorescente, indicatoare de tensiune, chiar în membranele celulare ale neuronilor. Cu ajutorul microscopului potrivit, ei pot vedea apoi cum celulele se luminează în timp ce vorbesc între ele – fie că este vorba de o șoaptă sau de un strigăt. Imagistica de tensiune poate, de asemenea, să înregistreze discuțiile electrice dintre mai mulți neuroni în același timp și apoi să calculeze media acestor semnale pe bucăți mari de țesut cerebral. Acest lucru îi ajută pe cercetători să studieze activitatea electrică a creierului la diferite scări spațiale, ascultând nu numai vocile celulelor individuale, ci și „vuietul mulțimii”, spune Cohen.
În ultimii 5 ani, oamenii de știință au publicat aproximativ 1.000 de lucrări pe această temă, iar schemele majore de finanțare, cum ar fi inițiativa BRAIN a Institutelor Naționale de Sănătate din SUA (US National Institutes of Health), au accelerat dezvoltarea de noi tipuri de indicatori de tensiune obținuți prin inginerie genetică. În speranța de a găsi variante mai bune, unele grupuri au venit cu strategii pentru a examina milioane de proteine în funcție de caracteristicile dorite, cum ar fi luminozitatea. O astfel de abordare a identificat un indicator care este de două ori mai luminos decât senzorii similari dezvoltați cu doar patru ani mai devreme2.
Pe măsură ce aceste proteine se îmbunătățesc, iar progresele în domeniul microscopiei facilitează observarea lor, oamenii de știință speră să lumineze cea mai mare enigmă a neuroștiinței: modul în care celulele creierului lucrează împreună pentru a transforma un sistem de impulsuri electrice în gânduri, acțiuni și emoții. Cercetătorii încă se străduiesc să surprindă întreaga gamă de activități și să conceapă modalități de a vedea nervii care trag rapid și profund în țesutul cerebral. Dar dacă progresele pot rezolva aceste provocări tehnice, „ar fi revoluționar”, spune Rafael Yuste, care studiază funcția circuitelor neuronale la Universitatea Columbia din New York.
Proces de mare viteză
Creierul uman mediu conține aproximativ 120 de miliarde de neuroni, care primesc și trimit constant informații prin intermediul unor apendice asemănătoare unor ramificații numite dendrite. Semnalele chimice sau electrice care ajung la dendrite produc mici modificări de tensiune de-a lungul membranei celulei, care sunt direcționate către corpul celular. Atunci când suma modificărilor de tensiune atinge un punct de neîntoarcere, numit prag, neuronul declanșează un vârf electric mare – un potențial de acțiune. Acest șoc zbârnâie cu o viteză de până la 150 de metri pe secundă de-a lungul unei ramuri neuronale, cunoscută sub numele de axon, către un alt set de anexe ramificate. Aici, semnalele chimice sau electrice transmit informația către următorul set de dendrite.
Semnele neuronale converg, diferă și se sincronizează pentru a produce o simfonie de gânduri, emoții, acțiuni și reacții, de la roșeața unei fețe până la sughițul unui copil. Dar instrumentele de ascultare ale oamenilor de știință sunt extrem de limitate. Dezvoltați pentru prima dată în anii 1940, electrozi miniaturali subțiri cât un fir de păr pot fi introduși în creier, pe lângă sau în interiorul neuronilor, unde măsoară tensiunea membranei cu precizie și rapiditate. Dar această abordare poate fi folosită pentru a monitoriza doar unul sau o mână de neuroni deodată – și doar pentru o perioadă limitată de timp, deoarece electrozii deteriorează în cele din urmă celula. Este ca și cum ai încerca să înțelegi esența unui aranjament orchestral urmărind un singur interpret timp de câteva secunde.
Bucăți de microelectrozi pot înregistra activitatea electrică a până la 200 de celule deodată, dar pentru că acești electrozi sunt plasați în apropierea neuronilor, mai degrabă decât în interiorul lor, ei pot detecta doar potențialele de acțiune, cele mai ascuțite vârfuri în activitatea electrică. Ei sunt surzi la notele mai slabe – micile schimbări electrice care nu împing neuronul până la un potențial de acțiune. Aceste modificări de tensiune sub prag sunt esențiale pentru funcționarea creierului, deoarece ele se adună treptat pentru a determina dacă un neuron va porni sau nu.
În speranța de a măsura activitatea cerebrală mai liniștită în populații mai mari de celule, oamenii de știință din anii 1960 au început să se joace cu ideea unui senzor sau a unei sonde care să devină fluorescentă ca răspuns la un semnal electric. Cele mai populare sonde, numite indicatori de calciu, se aprind atunci când se leagă de calciu, care curge în neuron ca urmare a unui vârf de activitate electrică. Dar tehnica, cunoscută sub numele de imagistică a calciului, oferă doar o aproximare; ea nu înregistrează direct tensiunea membranară. Și, deși va arăta semnalul unor evenimente mari, cum ar fi potențialele de acțiune, aceasta ratează lucruri care sunt cruciale pentru funcționarea creierului, cum ar fi oscilațiile subtile ale tensiunii membranare sau semnalele electrice care inhibă potențialele de acțiune. Imaginați-vă că ați putea auzi doar o rafală de aplauze după un concert simfonic: este clar că orchestra a cântat, dar ceea ce cânta este o presupunere pentru oricine.
În anii 1970, oamenii de știință au început să dezvolte senzori cu coloranți care detectează direct modificările tensiunii membranare. Primele versiuni ale acestor coloranți trebuiau să fie vopsite pe creier fără discriminare, astfel încât acestea marcau toate tipurile de celule, inclusiv celulele neuronale, ceea ce făcea dificilă descifrarea activității unor neuroni specifici.
Apoi, în anii 1990, cercetătorii au început să testeze indicatori care puteau fi modificați genetic pentru a apărea doar în neuronii de interes. Primul3 indicator de tensiune codificat genetic (GEVI) a fost dezvoltat în 1997; de atunci, oamenii de știință au produs mai mult de două duzini de senzori4. Unii dintre aceștia sunt realizați prin combinarea unei proteine sensibile la tensiune cu molecule fluorescente (a se vedea „The flavours of fluorescence”). Atunci când aceste proteine detectează o schimbare de tensiune, își schimbă structura 3D și modifică fluorescența moleculei cu care sunt cuplate. Alți indicatori de tensiune sunt versiuni mutante ale rodopsinelor microbiene, molecule fluorescente care provoacă o schimbare de tensiune de-a lungul membranei plasmatice ca răspuns la lumină. Aceste proteine pot funcționa, de asemenea, în sens invers, modificându-și răspunsul la lumină – și, prin urmare, fluorescența lor – ca răspuns la o modificare a tensiunii membranare.
Toate în detaliu
Până în prezent, GEVIs s-au dovedit a fi un succes în urmărirea potențialelor de acțiune individuale atât în neuronii de cultură, crescuți într-o farfurie, cât și în creierele intacte ale unei game largi de animale, de la insecte5 la șoareci6. Una dintre cele mai mari promisiuni ale tehnicii este potențialul său de a înregistra nu numai evenimentele mari, ci și micile modificări sub prag ale tensiunii membranare care reflectă mesajele pe care un neuron le primește de la celulele vecine, spune Cohen. „Imagistica de tensiune vă permite să vedeți intrările neuronilor in vivo, pe care nu aveam cum să le observăm anterior”, spune el.
În ultimul an, Cohen și colegii săi au dezvoltat noi GEVI și au îmbunătățit tehnicile de microscopie pentru a înregistra astfel de modificări de tensiune sub prag de la mulți neuroni deodată, inclusiv în creierul de șoarece7,8. Echipa a reușit, de asemenea, să înregistreze activitatea electrică a acelorași neuroni până la o săptămână mai târziu. Capacitatea de a ști exact ce neuroni sunt înregistrați și de a le ține evidența în timp le permite cercetătorilor să analizeze cablajul dintre acești neuroni, spune Ed Boyden, cercetător în neuroștiințe la Massachusetts Institute of Technology din Cambridge. În acest fel, „se poate face legătura între structura creierului și funcția sa”, spune el. „Aceasta este una dintre întrebările de bază în toate neuroștiințele.”
Un alt avantaj al GEVI-urilor este că, spre deosebire de electrozi, care înregistrează în principal semnale din corpul celular, acestea pot înregistra semnale electrice din orice parte a unei celule nervoase, până la vârfurile dendritelor (vezi „Atingerea balanței”). Este ca și cum ai putea asculta în mod specific notele cântate de mâna stângă a unui pianist. „Acesta este un lucru la care visez de mult timp – și nu sunt singura”, spune Katalin Toth, neurobiolog la Universitatea Laval din Quebec, Canada. Mulți neuroștiințiști se străduiesc să urmărească tensiunea de-a lungul unor neuroni întregi pentru a vedea cum se schimbă în diferite regiuni ale celulei, spune ea.
Wei Wei, neurobiolog la Universitatea din Chicago, Illinois, folosește GEVI pentru a afla cum sunt integrate diferite intrări electrice în neuronii din retina de șoarece. Wei este interesat de o clasă de neuroni care răspund mai puternic la un stimul vizual atunci când acesta se deplasează într-o anumită direcție. Prin observarea modului în care tensiunea membranară se modifică în diferite părți ale acestor neuroni, ea speră să înțeleagă modul în care celulele însumează semnalele primite pentru a detecta direcția mișcării.
Neurofiziologul Vincent Villette de la Școala Normală Superioară din Paris intenționează să utilizeze senzori de tensiune pentru a studia modul în care fluctuațiile regulate ale semnalelor electrice sub prag determină modul în care neuronii din cerebelul de șoarece coordonează activitatea musculară. „Sunt multe de înțeles cu privire la modul în care celulele acționează împreună”, spune Villette.
Obținerea unei lecturi vizuale a tensiunii membranare permite, de asemenea, oamenilor de știință să vadă semnalele electrice care inhibă declanșarea focului neuronal, mai degrabă decât să îl declanșeze. Deoarece semnalele inhibitorii sunt imposibil de înregistrat cu abordări precum imagistica calciului, nu este clar cum anume modelează ele activitatea cerebrală, spune Rosa Cossart, neurobiolog la Institutul Mediteranean de Neurobiologie din Marsilia, Franța.
Cossart a folosit electrozi și imagistică de calciu de ani de zile, dar acum este nerăbdătoare să încerce GEVIs. Ea speră că acești senzori îi vor permite să măsoare tensiunea la viteză mare în mai mulți neuroni – cel puțin 50 – în același timp într-un șoarece viu. Acest lucru ar ajuta la înțelegerea modului în care grupurile de neuroni integrează semnalele electrice – atât excitatorii, cât și inhibitorii – pentru a susține activități care sunt cruciale pentru dezvoltarea și funcționarea creierului, spune ea.
Provocări profunde
În ciuda așteptărilor mari, a face ca GEVIs să funcționeze în laborator poate fi o bătaie de cap. Luați exemplul lui Helen Yang: în calitate de studentă absolventă la Universitatea Stanford din California, ea a decis să încerce GEVIs ca modalitate de a studia neuronii din sistemul vizual al muștelor de fructe. Dar, uitându-se prin microscop în timpul primului ei experiment, Yang nu a văzut nicio schimbare în fluorescența celulelor, nici măcar atunci când a aprins o lumină puternică în ochii muștelor. Abia după ce a analizat datele, și-a dat seama că stimulii vizuali produceau un semnal, doar că era unul foarte mic. „Am fost destul de entuziasmată, dar colegii mei de laborator au fost mai puțin entuziasmați”, spune ea. „Răspunsurile erau destul de mici și zgomotoase.”
Yang a început să se joace cu setările microscopului, mărind puterea laserului și accelerând imagistica. „Practic, l-am făcut să meargă cât de repede putea microscopul nostru”, spune ea. Acest lucru se datorează faptului că răspunsul indicatorului la un semnal electric a fost atât de rapid încât modificarea fluorescenței a fost detectabilă doar pentru o fracțiune de secundă. „Dacă surprindeți doar un singur cadru în timpul în care celula răspunde, răspunsul nu pare deloc mare”, spune Yang.
Yang a reușit în cele din urmă să folosească GEVIs pentru a investiga modul în care neuronii muștelor procesează indicii vizuale5, dar tipurile de provocări cu care s-a confruntat au împiedicat până acum ca imagistica de tensiune să devină o tehnică obișnuită. Aceasta necesită platforme microscopice avansate, adesea construite la comandă, spune Cohen. „Nu poți face acest lucru doar pe microscopul fluorescent al bunicii tale”.
În ultimii cinci ani, sprijinul financiar din partea inițiativei BRAIN a impulsionat progresele în acest domeniu, inclusiv dezvoltarea unor GEVI-uri mai bune, spune Michael Lin, inginer de proteine la Stanford.
În paralel cu dezvoltarea de noi senzori, oamenii de știință lucrează la tehnici de imagistică cu precizie a semnalelor electrice rapide care călătoresc prin creier. Una dintre provocări este că majoritatea tehnicilor disponibile funcționează bine doar cu celule aflate într-o farfurie sau pe suprafața creierului. Dar creierul mamiferelor nu este transparent: de fapt, arată ca un tofu, spune Na Ji, fizician la Universitatea din California, Berkeley.
Pentru a privi mai în profunzime, cercetătorii trebuie să apeleze la metode mai invazive, cum ar fi îndepărtarea unei părți din țesutul suprapus sau lipirea unor dispozitive optice minuscule numite micro-endoscoape direct în creier. O modalitate alternativă, neinvazivă, de a privi în țesuturile opace – până la 1 milimetru adâncime – este microscopia cu doi fotoni. Această tehnică utilizează o lumină cu lungime de undă mai mare și energie mai mică, care poate pătrunde mai adânc în țesuturi. Deoarece microscoapele cu doi fotoni iluminează și înregistrează dintr-un singur punct la un moment dat, acestea captează imagini prea lent pentru a urmări o mare parte din discuțiile rapide ale creierului. Dar specialiștii sunt încrezători că progresele tehnologiei vor face în curând posibilă observarea semnalelor produse de GEVIs la o viteză mai mare. „Este absolut fezabil”, spune Ji.
Dacă diferitele abordări pot depăși aceste provocări, oamenii de știință nu au nicio îndoială că imagistica de tensiune va deveni o abordare standard pentru măsurarea activității creierului. „În următorul an sau doi, vom vedea o mulțime de lucrări care au aplicat senzori de tensiune și au învățat despre biologie”, spune Thomas Clandinin, un neurobiolog de la Stanford. Unii spun că tehnica ar putea chiar să înlocuiască electrozii pentru întrebări legate de modul în care neuronii procesează și integrează informațiile.
Cercetătorii aflați la început de carieră sunt deosebit de optimiști: Hochbaum, care este acum bursier postdoctoral la Harvard Medical School din Boston, spune că, pe termen lung, GEVIs va fi un instrument de bază pentru a studia modul în care diferite compartimente din celulă răspund la semnale sub prag. El intenționează să utilizeze imagistica de tensiune pentru a înțelege modul în care astfel de semnale modifică conexiunea dintre neuroni, un proces-cheie în învățare. Posibilitățile sunt incitante, spune Hochbaum, dar a învățat cel puțin o lecție importantă din acele zile de început în care sărea în laborator de bucurie după ce vedea o strălucire în microscop: atunci când experimentele funcționează, păstrați sărbătorile la minimum.
.