Isolation and Identification of Volatiles
Ludzki nos odbiera wiele lotnych związków organicznych jako zapachy i te zapachy są często pierwszą wskazówką obecności pleśni. Charakterystyka chemiczna (izolacja, separacja, identyfikacja i kwantyfikacja) lotnych związków organicznych wymaga jednak zastosowania specjalistycznych metod analitycznych, odmiennych od metod stosowanych w tradycyjnej „mokrej” chemii. Postęp technologiczny, jaki dokonał się pod koniec XX i na początku XXI wieku, poprawił naszą zdolność do precyzyjnego wykrywania lotnych związków chemicznych, dokładnie i w niskich stężeniach (Zhang i Li, 2010; Hung i in., 2015). W skrócie, tradycyjne metody obejmują destylację z parą wodną i ekstrakcję ciecz-ciecz, a następnie koncentrację i weryfikację chemiczną poszczególnych związków. Niektóre z najwcześniejszych badań nad chemiczną naturą LZO przeprowadzono z wykorzystaniem ekstraktów chlorku metylenu, które skoncentrowano poprzez destylację z parą wodną i analizowano za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej i spektrometrii mas (MS). We wczesnych badaniach z zastosowaniem tej metody analizowano lotne związki organiczne Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae i Aspergillus parasiticus. Wszystkie cztery gatunki wytwarzały 3-metylobutanol, 3-oktanon, 3-oktanol, 1-okten-3-ol, 1-oktenol i 2-okten-1-ol. W przypadku A. niger ponad 90% zidentyfikowanej mieszaniny LZO składało się z 1-okten-3-olu, który jest związkiem zapachowym nadającym grzybom ich charakterystyczny zapach. W przypadku A. parasiticus, 1-okten-3-ol stanowił 35,6% całkowitej mieszaniny lotnej, podczas gdy pokrewny związek ośmiowęglowy, 2-okten-1-ol, który ma nieprzyjemny zapach stęchlizny, stanowił 34,8% (Kamiński i in., 1974).
Metody od tego czasu opierają się na chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS), która łączy rozdział chromatograficzny, identyfikację na podstawie widm masowych i retencji chromatograficznej oraz kwantyfikację próbek lotnych. Lotne związki organiczne w przestrzeni powietrznej kultur grzybów są zwykle zbierane przez stałe materiały sorpcyjne, takie jak węgiel aktywny lub włókno. Każda metoda zbierania ma wrodzone odchylenia i może dopuszczać do powstawania artefaktów; ogólnie rzecz biorąc, związki niepolarne są preferencyjnie zbierane w stosunku do związków polarnych. Chromatografia gazowa może również wprowadzać błędy, ponieważ czasami trudno jest oddzielić dwa związki od siebie, co prowadzi do ich pomieszania. Stwierdzono to w przypadku 2-metylo-1-butanolu i 3-metylo-1-butanolu, izomerów różniących się jedynie przeniesieniem jednej grupy metylowej (Börjesson i in., 1992). Inne wady analizy GC-MS obejmują potrzebę wykwalifikowanych operatorów, względne koszty oraz fakt, że nie jest ona skuteczna w przypadku bardziej reaktywnych LZO (Elke i in., 1999; Gao i in., 2002; Gao i Martin, 2002; Rappert i Müller, 2005).
Mikroekstrakcja w fazie stałej (SPME) jest popularną i przenośną metodą. LZO są najpierw absorbowane i koncentrowane na włóknie, a następnie dostarczane do detektora, gdzie następuje desorpcja w samym iniektorze GC. SPME jest dobrze przystosowana do pobierania próbek środowiskowych, które są następnie transportowane do laboratorium w celu identyfikacji. W połączeniu z GC-MS jest wygodnym i szeroko stosowanym sposobem jakościowej identyfikacji LZO z hodowli mikroorganizmów lub ze skażonych budynków (Fiedler i in., 2001; Wady i in., 2003; Jeleń i Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). SPME jest często najlepszym podejściem do określania względnej ilości docelowego związku lotnego w sytuacji eksploracyjnej lub w przypadku powtarzalnych procesów pobierania próbek. Jednakże nie jest ono przydatne do identyfikacji nowych związków.
Opracowano wiele specjalistycznych metod analitycznych, które uzupełniają klasyczne metody GC-MS i mogą być przydatne do analiz ukierunkowanych. Na przykład, spektrometria mas z reakcją transferu protonów (PTR-MS) jest przydatna do szybkiego pobierania próbek i wykrywania niskich stężeń (Kamysek i in., 2011; Schwoebel i in., 2011). Metoda ta znalazła zastosowanie w naukach o środowisku, technologii żywności i diagnostyce medycznej (Gasperi i in., 2001; Cappellin i in., 2013).
Używając termicznej desorpcji (TD)-chromatografii gazowej/spektroskopii masowej, scharakteryzowano in vitro profil lotnych metabolitów Aspergillus fumigatus, wskazując na charakterystyczną sygnaturę zawierającą monoterpeny: kamfen, α- i β-pinen, limonen; oraz związki seskwiterpenowe: α- i β-trans-bergamoten (Koo i in., 2014).
Selected ion flow tube-mass spectrometry (SIFT-MS) ma zdolność do wykrywania mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z szybkością i czułością w umiarkowanie złożonej mieszaninie gazów. Jest ona w stanie namierzyć LZO w niskich stężeniach części na miliard i może mierzyć niektóre związki w zakresie części na bilion. W tej technice, całkowite LZO są jonizowane w rurce przepływowej, nie wymagając separacji chromatograficznej (Syhre i in., 2008; Chambers i in., 2011). Metoda ta została wykorzystana do ilościowego oznaczania lotnych związków organicznych emitowanych przez A. fumigatus w kokulturach z bakteriami, które często występują w chorych płucach ludzkich. Hodowle z A. fumigatus wytwarzały „kopalne” ilości amoniaku i organicznych związków siarki metanetiolu (znanego również jako merkaptan metylowy), siarczku dimetylu i disiarczku dimetylu (Chippendale i in., 2014).
Symultaniczna ekstrakcja destylacyjna (SDE) obejmuje krótkie włókno krzemionkowe pokryte materiałem organicznym jako fazę stacjonarną w celu skoncentrowania LZO, które są następnie desorbowane w gorącym iniektorze. SDE była stosowana do określania składników lotnych w analizie środowiskowej, żywności, kryminalistycznej, olejów, farmaceutycznej i polimerów w celu uzyskania bardziej skoncentrowanych próbek (Orav et al., 1996). Na przykład, niektóre związki smakowe były badane przy użyciu kombinacji SDE i SPME. Związki smakowe mogą być analizowane ilościowo przez SDE, podczas gdy SPME jest używany do prostych, szybkich, rutynowych badań przesiewowych (Cai et al., 2001).
Multicapillary column-ion mobility spectrometer (MCC-IMS) ma czułość do części na bilion zakres, szybkie i wymaga niskiej wiedzy technicznej. Charakterystyczne metabolity gatunków A. fumigatus i Candida zostały zróżnicowane w analizie przestrzeni nad głową przy użyciu tego podejścia (Perl i in., 2011).
Elektroniczne nosy (e-nosy) przekształcają substancje lotne w sygnały elektryczne oparte na interakcji z powierzchniami elektronicznymi i mogą być wykorzystywane do wykrywania znanych związków. E-nosy składają się z grupy czujników chemicznych o różnej selektywności, jednostki wstępnego przetwarzania sygnału i systemu rozróżniania wzorców (Gardner i Bartlett, 1994). Różne lotne związki organiczne tworzą charakterystyczny odcisk palca, który może być rozróżniony przez porównanie z wcześniej zarejestrowanymi wzorcami w systemie rozpoznawania. Medyczne zastosowanie e-nosów początkowo koncentrowało się na patogenach bakteryjnych lub chorobach nieinfekcyjnych, takich jak rak płuc, przewlekła obturacyjna choroba płuc i astma (Valera i in., 2012). W zależności od zastosowania, do celów diagnostycznych wykorzystuje się próbki lotnych związków organicznych z wymazów, plwociny, surowicy, kału, oddechu lub moczu. Próbki oddechu zostały wykorzystane do wczesnego wykrywania aspergilozy (de Heer et al., 2013).
Pozostaje wiele technicznych wyzwań w pracy z grzybiczymi LZO, a porównanie wyników uzyskanych między różnymi laboratoriami jest często trudne. Ten sam gatunek grzyba może mieć różne profile LZO w oparciu o nieznane lub niekontrolowane czynniki środowiskowe i genetyczne. Ponadto, zastosowany protokół eksperymentalny może drastycznie wpłynąć na profil LZO. Na przykład, w pracy nad Aspergillus flavus, de Lucca et al. (2010) wykryli tylko jeden terpen używając SPME do zbierania lotnych związków przed poddaniem ich GC-MS. Później, stosując koncentrator próbek przed poddaniem ich innemu modelowi instrumentu GC-MS, grupa ta była w stanie wykryć kilka terpenów (de Lucca et al., 2012). Sposób postępowania z materiałami przed eksperymentem może powodować artefakty, a autoklawowanie może powodować powstawanie niebiogennych lotnych substancji (Börjesson i in., 1992). Ponieważ dane są często niespójne w różnych próbach, niektórzy autorzy kwestionują odtwarzalność mikrobiologicznej emisji LZO (Schleibinger et al., 2002). Przyszłe prace z grzybowymi LZO muszą być świadome wielu czynników, które mogą wpływać na wyniki. Byłoby użyteczne, gdyby wytyczne dotyczące najlepszych praktyk zostały opracowane przez społeczność naukowców, którzy badają grzybowe LZO.