18O znakowanie: narzędzie dla proteomiki

Ocena proteolitycznego znakowania i kwantyfikacji białek dla celów diagnostycznych przy użyciu trypsyny i 18O wzbogaconego H2O jest przedstawiona. Wykazaliśmy, że kwantyfikacja porównawcza lub względna może być skutecznie przeprowadzona przy użyciu tego podejścia. Opracowaliśmy protokół, który pozwala na przechowywanie znakowanych peptydów w wodzie o naturalnej objętości bez obawy o wymianę zwrotną, pod warunkiem, że pH jest wystarczająco niskie, aby wygasić aktywność katalityczną trypsyny, ale nie tak niskie, aby promować chemiczną wymianę zwrotną. Ponieważ wydajność znakowania zależy od rodzaju peptydu, nie istnieje prosta liniowa zależność między względną zawartością mieszaniny buforowej 16O/18O (x) a wydajnością znakowania (y); jest to raczej zależność oparta na prawdopodobieństwie y = x(2). W związku z tym, zakres znakowania peptydów przy zastosowaniu proporcji mieszaniny buforowej 16O/18O może znacznie odbiegać od oczekiwanego na podstawie zależności liniowej. Ocena względnej wydajności Ziptipa wskazała na utratę odzysku próbki w miarę zmniejszania stężenia peptydu w normalnych warunkach, co sugeruje, że istnieje granica, poniżej której występują malejące zyski. Ponadto, straty adsorpcyjne spowodowane wysychaniem i odzyskiwaniem Speedvac wykazały niewielkie (20%) straty, które mogą się znacznie różnić (0-50%) w zależności od peptydu. Wydajność trawienia w roztworze standardowych mieszanin białek w funkcji stężenia wykazała liniowy spadek wraz z malejącym stężeniem. Jest to zgodne z efektami kinetycznymi enzymów i podkreśla potencjalny błąd kwantyfikacji, który może pojawić się podczas oceny ekspresji różnicowej opartej na detekcji peptydów. Wyniki naszych badań pokazują możliwości znakowania 18O jako narzędzia optymalizacyjnego dla rozwoju procesów proteomicznych.