Analiza i kwantyfikacja fuzji mioblastów in vitro przy użyciu LADD Multiple Stain

Dorosła tkanka mięśni szkieletowych zawiera populację komórek prekursorowych, znanych jako komórki satelitarne, które są odpowiedzialne za naprawę mięśni szkieletowych (1-3). Aktywowane komórki satelitarne (mioblasty) migrują do miejsca urazu mięśnia, gdzie proliferują, różnicują się i łączą w wielojądrowe miotuby (3-5). Ostateczny sukces tego procesu mierzy się stopniem, w jakim rezydujące mioblasty połączyły się podczas końcowego różnicowania.

Aby doświadczalnie ocenić fuzję mioblastów in vitro, oblicza się indeks fuzji w oparciu o wykrywanie immunofluorescencji za pomocą mikroskopii. Przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są używane do wykrywania białek strukturalnych włókien mięśniowych, takich jak łańcuch ciężki miozyny (MyHC) i desmina, lub alternatywnie, znakowana fluorescencyjnie falloidyna może być używana do wizualizacji F-aktyny (6-9). Jądra komórkowe są znakowane fluorescencyjnie przy użyciu związku wiążącego DNA, takiego jak Hoechst 33258. Następnie oblicza się odsetek jąder w miocytach z ≤3 jądrami (9) lub odsetek jąder w miotubach MyHC-pozytywnych (10). Podejścia te są dobrze ugruntowane; wymagają one jednak rozległej, czasochłonnej optymalizacji w celu wygenerowania silnego i specyficznego sygnału dla antygenu zainteresowania i późniejszej analizy fuzji. Jeśli wykorzystywane są przeciwciała znakowane fluorescencyjnie, dostęp do mikroskopu fluorescencyjnego jest dodatkowym wymogiem, który nie jest dostępny we wszystkich instytucjach. Późniejsza ocena ilościowa wymaga pracochłonnej i czasochłonnej analizy wielu pól widzenia w celu uzyskania wskaźnika fuzji reprezentatywnego dla populacji. Te ograniczenia, wraz ze względnym kosztem testów opartych na przeciwciałach, skłoniły nas do opracowania szybkiego, opłacalnego testu in vitro do ilościowej oceny fuzji mioblastów przy użyciu szeroko dostępnego LADD Multiple Stain.

LADD Multiple Stain (11) jest połączonym barwnikiem jądrowym i cytoplazmatycznym, który zawiera fuksynę i błękit toluidyny (Cat. #70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Do naszych badań, świeży LADD jest przygotowywany tak, aby zawierał 0,365 g błękitu toluidyny (Cat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 0,135 g fuksyny (Cat. #47860-25G; Sigma- Aldrich) w końcowej objętości 50 ml 30% etanolu. Roztwór miesza się do rozpuszczenia, a następnie filtruje przez bibułę filtracyjną Whatman (numer 4) (nr kat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Barwnik LADD może być przechowywany w plastikowym lub szklanym pojemniku w temperaturze pokojowej i może być użyty ponownie. Komórki, które mają być wybarwione są przemywane buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) i utrwalane w 70% etanolu przez 10 minut. Etanol usuwa się i dodaje 500 µL barwnika LADD, zapewniając pełne pokrycie komórek. Komórki są inkubowane przez 1 minutę, po czym barwnik jest usuwany, a komórki są wielokrotnie przemywane wodą destylowaną, aż do momentu, gdy LADD przestanie przenikać do wody. Następnie komórki pozostawia się do wyschnięcia i przechowuje w temperaturze pokojowej do czasu oglądania w mikroskopie fazowo-kontrastowym. Aby poprawić oświetlenie podczas oglądania, wybarwione komórki mogą być zanurzone w PBS.

Aby określić, czy ten barwnik może być z powodzeniem wykorzystany do wizualizacji fuzji mioblastów, komórki C2C12 były hodowane do 80% konfluencji (Figura 1A) w standardowych warunkach hodowlanych (12). Następnie zmieniono podłoże na podłoże różnicujące zawierające 2% surowicy końskiej, co spowodowało fuzję w miotuby (Figura 1B). Udane różnicowanie zostało potwierdzone przez zwiększoną ekspresję MyHC (Figura 1D) w porównaniu z komórkami niezróżnicowanymi (Figura 1C). Po barwieniu LADD, niezróżnicowane mioblasty C2C12 wykazują jasnofioletową cytoplazmę i ciemniejsze jądro (Figura 1E; strzałka). Jednak po zróżnicowaniu cytoplazma miotuby wydaje się ciemnofioletowa (Figura 1F; groty strzałek), podczas gdy jaśniejsze jądra są wyraźnie widoczne w obrębie wielojądrowej komórki (Figura 1F; strzałka). Dlatego po LADD Multiple Stain obserwuje się wyraźnie zdefiniowane jądra, które są tak samo łatwe do odróżnienia od cytoplazmy wielojądrzastej miotuby (Figura 1F), jak oglądane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej po immunocytochemii (Figura 1D).

Aby określić, czy analiza obrazu może być użyta do pomiaru postępu fuzji mioblastów, komórki C2C12 różnicowano przez 6 dni, a obrazy komórek barwionych LADD wykonano przy 200-krotnym powiększeniu za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego Olympus CKX41 (Olympus Corporation, Tokio, Japonia). Jak oczekiwano, liczba łączących się miocytów i miotub wyraźnie wzrastała w każdym kolejnym dniu różnicowania (Figura 2A). Następnie obliczono indeks fuzji i zaobserwowano, że różnicujące się mioblasty stopniowo zwiększają swój indeks fuzji z 0,45% (dzień 1) do 31,4% (dzień 6) (Figura 2B). Indeks fuzji uzyskany w ten sposób porównuje się korzystnie z indeksem obliczonym przy użyciu standardowej immunocytochemii (w celu wykrycia MyHC) i barwienia jądrowego (13). Aby określić, czy oprogramowanie do analizy ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) może być przystosowane do ilościowego określenia obszaru miofibryli (jako miary fuzji), opracowano makro i przetestowano je na obrazach przedstawionych na Figurze 2A. Makro zostało skonfigurowane w następujący sposób, a następnie zapisane:

• Otwórz ImageJ i kliknij „Plugins = > Macros = > Startup Macros”

• Zastąp istniejący tekst kodowaniem przedstawionym w Tabeli Uzupełniającej S1.

Obrazy są otwierane w ImageJ, a makro jest uruchamiane przez kliknięcie „Macros = > Run Macro”. W ten sposób obrazy będą analizowane jeden po drugim. Użytkownik musi się upewnić, że próg został ustawiony prawidłowo; analizowany powinien być tylko obszar miofibryli. Próg koloru może być zmieniony poprzez edycję linii makra „setThreshold(0,130)”; poprzez zwiększenie drugiej liczby, więcej lekko zabarwionych obszarów zostanie uwzględnionych, podczas gdy więcej obszarów zostanie wykluczonych, gdy liczba ta zostanie zmniejszona. Używając tej metody, obszar miofibryli osiągnął 29,6% w dniu 6 (Figura 2C), dobrze porównując się z indeksem fuzji obliczonym dla tego samego punktu czasowego (Figura 2B). Barwniki Jennera i Giemsy mogą być również używane do barwienia mio-tub do mikroskopii świetlnej w podobny sposób jak LADD, jednak barwienie LADD jest wielokrotnie szybsze, a opracowane przez nas makro ImageJ pozwala na większą kontrolę nad tym, które obszary są mierzone (14).

Aby dalej zwalidować użycie LADD Multiple Stain do analizy fuzji, komórki C2C12 były różnicowane przez 5 dni w obecności lub braku 10 µM BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK), a następnie utrwalane i barwione LADD, jak opisano wcześniej. BB94 jest komercyjnie dostępnym syntetycznym inhibitorem metaloproteazy macierzy, który, jak wcześniej wykazano, zmniejsza fuzję mioblastów (15,16). W obecności BB94 wskaźnik fuzji zmniejszył się znacząco z 50% (kontrola DMSO) do 22% (P < 0,05) (Figura 2D); analiza obszaru miofibryli ujawniła ten sam trend, z fuzją zmniejszoną z 46% (kontrola DMSO) do 21% (P < 0.05) w obecności BB94 (Figura 2E).

Tutaj przedstawiamy szybką, nowatorską metodę barwienia zarówno struktury miofibrylarnej, jak i powiązanych mioonuklei przy użyciu LADD Multiple Stain. ImageJ jest następnie używany do dokładnej oceny obszaru włókien mięśniowych jako miary fuzji. Stosunkowo niski koszt LADD i znacznie zredukowany czas wymagany do przetwarzania i analizy oznacza, że fuzja może być teraz szybko analizowana w standardowym laboratorium bez potrzeby stosowania immunocytochemii i mikroskopii fluorescencyjnej.

.