Dual-responsive (pH/temperature) Pluronic F-127 hydrogel drug delivery system for textile-based transdermal therapy

Characterization of chemically synthesized TMC and PEG-HA

Widma 1H-NMR TMC i chitozanu przedstawiono na Rys. 2A, gdzie chitozan wykazywał piki przy 2,68 ppm dla H-2 oraz liczne piki w zakresie 3,85-3,55 ppm dla H-3 do H-6. Pik dla grupy N-trimetylowej (-NMe3) TMC wykryto przy 3,36 ppm, co potwierdza obecność N-metylacji i odnosi się do miejsc kwaternizowanych. Wraz z otrzymywaniem TMC na drodze jednoetapowej N-metylacji, zsyntetyzowano jako produkt uboczny modyfikowaną pochodną chitozanu z NMe2 (2,28 ppm).

Widma 1H NMR chitozanu i TMC (A); HA i PEG-HA (B).

Jak pokazano na Rys. 2B, HA wykazywał pik przy 3,21 ppm dla glukozydowego H oraz pik aeetylowego H przy 1,89 ppm. HA po reakcji z OMe-PEG2000-NH2 wykazywał pik etylenowy H (3,60 ppm) i pik (-NH-CH2-CH2-O-) H (2,76 ppm) OMe-PEG2000-NH2, wskazując, że PEG-HA został z powodzeniem utworzony w reakcji sprzęgania amidowego (Rys. 2B). Pozostałe piki PEG-HA są bardzo podobne do pików HA.

Widma FT-IR chitozanu i TMC przedstawiono na rys. 3A. TMC wykazywał charakterystyczne piki: O-H/N-H stretching (3431 cm-1); C-H stretching, pierścień piranozowy (2919 cm-1); C=O stretching, amid NH-Ac (1654 cm-1); C-H stretching, metyl TMC (1503 cm-1); C-H bending, CH3CO (1390 cm-1); oraz C-O-C stretching (1158, 1066 cm-1). Rysunek 3A pokazuje, że piki spektralne chitozanu są podobne do tych z TMC. Chitozan wykazywał rozciąganie O-H/N-H przy 3421 cm-1, rozciąganie C-H pierścienia piranozowego przy 2880 cm-1, rozciąganie C=O amidu NH-Ac przy 1654 cm-1, zginanie C-H CH3CO przy 1390 cm-1 oraz rozciąganie C-O-C przy 1155 i 1078 cm-1. Pik przy 1503 cm-1 dla wiązań C-H grup metylowych w TMC odpowiada dodaniu grup trimetylowych do grup aminowych chitozanu.

WidmaFTIR chitozanu i TMC (A); HA i PEG-HA (B).

Charakterystyczne piki FTIR PEG-HA pokazane na Rys. 3B to rozciąganie O-H (3428 cm-1), rozciąganie C-H, pierścienia piranozowego (2892 cm-1), rozciąganie C=O, NH-Ac (1644 cm-1) i rozciąganie C-N (1473 cm-1). HA wykazywał podobne charakterystyczne piki jak PEG-HA, a piki spektralne HA to: rozciąganie O-H (3438 cm-1); rozciąganie C-H, pierścień piranozowy (2899 cm-1); oraz rozciąganie C=O, NH-Ac (1615 cm-1). Pik znajdujący się przy 1473 cm-1 dla PEG-HA wskazuje na sprzężenie amidowe HA z OMe-PEG2000-NH2.

Analiza lepkości dynamicznej i wyniki inwersji rurowej (termoreaktywność preparatów hydrożelowych)

W tym badaniu zmierzono wartości lepkości dynamicznej preparatów w funkcji temperatury przy stałej szybkości ścinania 85 s-1, a konwersję fazy zolu do fazy żelu w zależności od temperatury przedstawiono na Rys. 4I. Wartości lepkości dynamicznej (Pa.s) preparatów hydrożelowych PF127/TMC/PEG-HA i PF127 obciążonych kwasem galusowym stopniowo zmieniały się wraz ze wzrostem temperatury w zakresie 5-50 °C, a od punktu przegięcia oba preparaty wyraźnie wykazywały przejście zol-żel w temperaturze 37 °C. Ponadto zawartość PF127 w obu preparatach wynosiła 13,5 % mas. w stosunku do całkowitej masy preparatów hydrożelowych, a temperatura żelowania obu próbek wynosiła 37 °C. Wartości lepkości dynamicznej hydrożeli PF127/TMC/PEG-HA i PF127 w temp. 37 °C wynosiły odpowiednio 7,02 Pa.s i 5,6 Pa.s. Wyższa wartość lepkości dynamicznej PF127/TMC/PEG-HA niż PF127 w temp. 37 °C wynikała z dodania TMC i PEG-HA do układu hydrożelowego na bazie PF127, co spowodowało wzmocnienie oddziaływań międzymikelarnych poprzez zwiększenie hydrofobowości całego układu1. Ponadto, wyższa wartość lepkości dynamicznej hydrożelu PF127/TMC/PEG-HA w punkcie żelowania sugerowała lepszą odporność na deformację pod wpływem naprężeń. W literaturze podaje się, że PF127 zachowuje się jak ciecz nienewtonowska w fazie żelu (37 °C), a wartości lepkości dynamicznej zmieniają się w funkcji szybkości ścinania52. PF127 w fazie zolu zachowywał się jak ciecz newtonowska52. W obecnym badaniu wartości lepkości dynamicznej preparatów w fazie zolu w temperaturze 5 °C wynosiły 0,40 Pa.s i 0,32 Pa.s odpowiednio dla PF127/TMC/PEG-HA i PF127, co jest zgodne z wartościami podawanymi wcześniej w literaturze52.

Metodę inwersji rurowej zastosowano do wizualizacji żelowania ze zmianą temperatury poprzez pomiar płynności PF127/TMC/PEG-HA, a układ wykazał odwracalne żelowanie z przejściem zol-żel w temperaturze 37 °C. Łańcuchy PF127 wraz z dwoma innymi związkami (TMC i PEG-HA) wykorzystują temperaturę jako wyzwalacz i tworzą hydrożele poprzez odwracalne fizyczne łączenie łańcuchów polimerowych53. Hydrożele powracają do stanu roztworu po usunięciu bodźca termicznego. Agregacja międzymikelarna polimerów termoreaktywnych w pobliżu temperatury żelowania wykazuje dodatnią zmianę entropii (ΔS) i ujemną zmianę energii swobodnej (ΔG) agregacji54. Asocjacje woda-woda powodują wzrost entropii znany jako efekt hydrofobowy, który jest siłą przewodnią tworzenia się żelu w LCST54.

Badanie reologiczne

Parametry reologiczne preparatów, a mianowicie lepkość złożoną (Rys. 5I), moduł zachowawczy (Rys. 5II) i moduł stratności (Rys. 5III) zilustrowano w funkcji temperatury. Jak widać na rysunku 5, wszystkie parametry reologiczne są silnie zależne od temperatury, a przemiana zol-żel w obu preparatach rozpoczyna się w pobliżu 30 °C, co wynika z punktu przegięcia wykresów. Po uformowaniu żelu wszystkie parametry reologiczne obu formulacji są znacznie wyższe niż ich fazy zolu. Wartości lepkości złożonej (I), modułu zachowawczego (II) i modułu stratności (III) PF127/TMC/PEG-HA są znacznie wyższe niż PF127 w stanie żelu, co wskazuje, że zmodyfikowane hydrożele PF127 z TMC i PEG-HA są mechanicznie silniejsze niż hydrożele PF127. Poprawa parametrów reologicznych hydrożelu PF127/TMC/PEG-HA może wynikać z silnych oddziaływań międzymikelarnych, a TMC i PEG-HA prawdopodobnie zwiększają stabilność miceli utworzonych przez PF127 w hydrożelu.

Badanie pęcznienia (pH-odpowiedzialność preparatów hydrożelowych)

Pęcznienie liofilizowanych cząstek hydrożelu w kwaśnym pH (pH 5,4) przy użyciu 0,1 M buforu octanowego w zależności od czasu (Rys. 6) w temperaturze 30 °C wykazało, że cząstki żelu utworzone przez PF127/TMC/PEG-HA w stanie napęczniałym opierały się całkowitemu rozpuszczeniu do 30 min, a następnie zaczęły się rozpuszczać w podłożu, by ulec całkowitej degradacji już po 2 h. Z kolei PF127 w stanie napęczniałym opierał się degradacji do 15 min, a uległ całkowitej degradacji po 1 h. Hydrofilowość PF127 zwiększała się w warunkach kwaśnych z powodu interakcji polimer-woda, co powodowało szybkie rozpuszczanie struktury żelu21. Reaktywność liofilizowanych cząstek hydrożelowych na pH została zmodyfikowana po dodaniu do układu TMC i PEG-HA, a wzmocniona interakcja międzymikelarna zmodyfikowanego układu hydrożelowego zapewniła odporność na degradację/rozpuszczenie cząstek żelowych pod wpływem kwasu przez dłuższy czas.

Pęcznienie cząstek żelowych w neutralnym pH (7,4) przy użyciu 0,1 M PBS w temperaturze 30 °C wykazało, że cząstki hydrożelowe pozostały spęczniałe przez 4 h bez żadnych dowodów na rozpuszczenie. Wskaźnik pęcznienia PF127/TMC/PEG-HA (5,01) przy pH 7,4 po 4 h był wyższy niż PF127 (4,23) wskazując, że połączona sieć porowata PF127/TMC/PEG-HA zgromadziła więcej cząsteczek wody w swojej strukturze w stanie spęcznienia (Rys. 6).

Badanie degradacji hydrożeli pod wpływem mieszania mechanicznego (badanie stabilności mechanicznej)

Badanie degradacji hydrożeli PF127/TMC/PEG-HA i PF127 pod wpływem mieszania mechanicznego (70 obr./min.) przez 14 dni w warunkach neuronowego pH wykazało, że PF127/TMC/PEG-HA oparł się degradacji żelu w większym stopniu niż hydrożel PF127 (Rys. 7). Hydrożel z PF127/TMC/PEG-HA wykazywał pozostałą masę 45,4% po 14 dniach mieszania mechanicznego, podczas gdy układ PF127 wykazywał większy ubytek masy po 14 dniach (pozostała masa 39,2%). Zatem stabilność mechaniczna hydrożelu została zwiększona po dodaniu TMC i PEG-HA do łańcuchów polimeru PF127 w formulacji, ponieważ w wyniku tej modyfikacji powstała bardziej połączona struktura hydrożelowa.

Badanie SEM i TEM formulacji hydrożelowych

Obrazy SEM formuły PF127 obciążonej kwasem galusowym (Rys. 8A,B) i hydrożeli PF127/TMC/PEG-HA (Rys. 8C,D) w stanie liofilizowanym wykazują aglomerowane struktury porowate z nieregularnymi rozmiarami porów po liofilizacji, ponieważ usunięcie wody spowodowało, że wszystkie wzajemnie połączone sieci w hydrożelu ułożyły się w stosy. Niemniej jednak, obraz PF127/TMC/PEG-HA (powiększona niebieska ramka na Rys. 8C) na Rys. 8D wykazuje lepiej połączoną sieć z bardziej wyraźnymi porami niż obraz samego PF127 (powiększona czerwona ramka na Rys. 8A), ponieważ interakcje międzymikelarne łańcuchów PF127 zostały wzmocnione po modyfikacji TMC i PEG-HA55. Załadowany lek wewnątrz hydrożelu był stosunkowo korzystniej rozmieszczony wewnątrz struktury żelowej PF127/TMC/PEG-HA, a trwałe i kontrolowane uwalnianie leku było lepsze w zmodyfikowanym układzie PF127 ze względu na bardziej połączoną strukturę porowatą w oryginalnej formulacji.

Obrazy TEM PF127 (Rys. 8E) i PF127/TMC/PEG-HA (Rys. 8F) w stanie zolu pokazują agregaty micelarne/połączone micele o rozmiarach od 100 do 1000 nm, które na obrazach pojawiają się jako granulki o różnych kształtach, jak wskazują czerwone kropkowane okręgi na Rys. 8E i niebieskie kropkowane okręgi na Rys. 8F. Jak widać na Rys. 8, micele utworzone w PF127/TMC/PEG-HA (F) były bardziej zwarte i stabilne niż te utworzone tylko z PF127 (E). Micele były tworzone głównie przez łańcuchy polimerowe PF127, a TMC i PEG-HA w formulacji PF127/TMC/PEG-HA wpływały na tworzenie się stabilnych i zwartych struktur międzymikelarnych lub agregatów micelarnych PF127 poprzez oddziaływania hydrofobowe. Dlatego też system dostarczania wykonany z hydrożelu PF127/TMC/PEG-HA może wykazywać dobre uwalnianie leku dzięki stabilnym strukturom międzymikelarnym.

Badanie hydrożeli metodą SAXS

Liofilizowaną postać hydrożeli pokrytą na szklanej płytce umieszczono równolegle do uchwytu próbki na przyrządzie do odbiciowego SAXS. Jak pokazano na Rys. 9, wartości I (a. u.) próbek hydrożeli zostały wykreślone względem q (Å-1). SAXS w trybie refleksyjnym jest wykonywana, gdy promieniowanie rentgenowskie uderza w płaską próbkę niemal równolegle do jej powierzchni i daje wyobrażenie o niejednorodności sieci hydrożelowej56. Wykres I (a. u.) vs q (Å-1) na Rys. 9 wykazał pojawienie się piku przy q = 0.02 Å-1, który jest obserwowany w hydrożelach wskazując na obecność zamrożonej niejednorodności i jest to spowodowane obecnością obszaru krystalizacji o wysokiej gęstości elektronowej pochodzącej z nieodłącznych defektów sieci hydrożeli57.

Refleksyjna SAXS poprzez pomiar I (a. u.) vs q (Å-1) hydrożeli obciążonych lekiem (A) PF127 i (B) PF127/TMC/PEG-HA.

Potencjał zeta preparatów hydrożelowych

Potencjał zeta preparatów w fazie zolu mierzono przez 14 dni w celu monitorowania stabilności składników układu podczas przechowywania. Ładunek powierzchniowy składników w formulacji określa ich stabilność, rozpuszczalność i klirens58, a ładunek powierzchniowy składnika jest mierzony przez potencjał zeta. Zarówno preparaty PF127 jak i PF127/TMC/PEG-HA z lekiem (kwasem galusowym) w fazie stałej wykazywały ujemne wartości potencjału zeta (Tabela 1). PF127 w fazie zolowej z załadowanym kwasem galusowym wykazywał ujemny potencjał zeta wynoszący -18,7 mV ± 6,1 w temperaturze 30 °C, a PF127/TMC/PEG-HA z lekiem (kwasem galusowym) w fazie zolowej wykazywał ujemną wartość potencjału zeta wynoszącą -16,3 mV ± 5,9. Jak pokazano w tabeli 1, wartości potencjału zeta PF127 i PF127/TMC/PEG-HA wynosiły odpowiednio -18,7 mV ± 6,5 i -14,6 mV ± 7,7, po 14 dniach przechowywania w temperaturze 30 °C. Wszystkie składniki preparatów były zatem równomiernie rozmieszczone w układzie bez wytrącania się, ponieważ nie stwierdzono istotnych zmian wartości potencjału zeta dla obu preparatów w okresie przechowywania. Ponadto, ładunki powierzchniowe miceli nie uległy znaczącej zmianie w formulacji PF127/TMC/PEG-HA, ponieważ TMC i PEG-HA są przeciwnie naładowane i dlatego wynikowy potencjał zeta PF127/TMC/PEG-HA jest podobny do potencjału zeta formulacji zawierającej tylko PF127.

BadanieFTIR hydrożeli obciążonych lekiem

Rycina 10 przedstawia charakterystyczne piki FTIR hydrożelu PF127/TMC/PEG-HA obciążonego kwasem galusowym w postaci liofilizowanej (cm-1), a piki te to 3445 (rozciąganie O-H), PF127, TMC, PEG-HA i kwas galusowy); 2891 (rozciąganie C-H), PF127, TMC, PEG-HA, i kwas galusowy; 1644 (rozciąganie C=O), TMC i PEG-HA; 1282 (rozciąganie C-O-C), PF127, TMC, i PEG-HA; 1110 (symetryczne rozciąganie C-C-O) PF127; 964 (asymetryczne rozciąganie C-C-O), PF127. Podobne charakterystyczne piki zaobserwowano na podstawie analizy FTIR hydrożelu PF127 z kwasem galusowym. Piki FTIR hydrożelu PF127 z kwasem galusowym w postaci liofilizowanej to 3445 cm-1 (rozciąganie O-H), PF127 i kwas galusowy; 2891 cm-1 (rozciąganie C-H), PF127 i kwas galusowy; 1282 cm-1 (rozciąganie C-O-C), PF127; 1110 (symetryczne rozciąganie C-C-O) PF127; i 964 (asymetryczne rozciąganie C-C-O), PF127. Szeroki pik znaleziony przy 3445 cm-1 obu formulacji hydrożelowych sugerował, że kwas galusowy został efektywnie załadowany do hydrożeli.

WidmaFTIR hydrożeli PF127 i PF127/TMC/PEG-HA załadowanych lekiem, podwójnie reagujących (pH/temperatura).

Badanie uwalniania kumulatywnego

Badanie uwalniania przeprowadzono w celu zbadania uwalniania kwasu galusowego z hydrożeli PF127/TMC/PEG-HA i PF127 w 0,1 M PBS (pH 7,4) i w temperaturze 37 °C (Rys. 11). W obu preparatach obserwowano gwałtowne uwalnianie leku (kwasu galusowego) w początkowej fazie (w ciągu 5 h), odpowiednio 64,60% ± 1,112 i 50,31% ± 0,411 dla hydrożeli PF127/TMC/PEG-HA i PF127. Po 5 dniach skumulowane uwalnianie leku wyniosło 87,61% ± 1,112 i 75,20% ± 0,411 odpowiednio dla hydrożeli PF127/TMC/PEG-HA i PF127.850 odpowiednio dla hydrożeli PF127/TMC/PEG-HA i PF127, co wskazuje, że zmodyfikowany układ hydrożelowy PF127 z TMC i PEG-HA lepiej sprawdza się jako system dostarczania leków. Zmiany morfologiczne PF127/TMC/PEG-HA, takie jak wzmocnione oddziaływania międzymikelarne i dobrze uformowana porowata struktura sieciowa, poprawiły uwalnianie leku w warunkach neutralnego pH.

Kumulatywne uwalnianie (%) leku (kwas galusowy) z (A) PF127 i (B) hydrożeli PF127/TMC/PEG-HA w pH 7,4 i 37 °C przez 5 dni w 0,1 (M) buforze PBS. Dane przedstawiają średnią z trzech powtórzeń eksperymentu uwalniania ± SD oraz dopasowanie danych uwalniania leku do trzech różnych modeli tempa uwalniania: zerowego rzędu, pierwszego rzędu i Higuchiego.

Ryc. 11 Wartości skumulowanego uwalniania leku (kwasu galusowego) z hydrożeli dopasowano do różnych modeli kinetycznych tempa uwalniania (Rys. 11), a stałe tempa dla różnych modeli tempa uwalniania dla wszystkich odmian hydrożeli zestawiono w Tabeli 2. Dopasowanie danych dotyczących uwalniania do różnych modeli szybkościowych wyrażono w wartościach R2 (Rys. 11).

Model szybkości zerowego rzędu jest dany równaniem:

gdzie Qt jest skumulowaną ilością leku uwalnianego z hydrożelu w czasie t (h), Qo jest początkową ilością leku załadowanego do hydrożelu, a k0 jest stałą szybkości zerowego rzędu (sek-1). Szybkość uwalniania leku według równania szybkości zerowego rzędu jest niezależna od początkowej ilości leku załadowanego do hydrożelu.

Model szybkości pierwszego rzędu jest dany przez następującą nieliniową postać:

gdzie Qt jest skumulowaną ilością leku uwalnianego z hydrożelu w czasie t (h), Qo jest początkową ilością leku załadowanego do hydrożelu, a k1 jest stałą szybkości pierwszego rzędu (sek-1). Szybkość uwalniania leku według równania szybkości pierwszego rzędu zależy od jego stężenia (początkowej ilości leku wprowadzonego do hydrożelu).

Równanie szybkości Higuchiego sugeruje uwalnianie leku z hydrożeli metodą dyfuzji, a nieliniowa postać równania szybkości Higuchiego to:

gdzie Qt jest skumulowaną ilością leku uwalnianego z hydrożelu w czasie t (h), a kH jest stałą Higuchiego (sek-0.5).

Pasowanie danych dotyczących uwalniania do różnych modeli szybkości (Rys. 11) wskazuje, że szybkość uwalniania leku z preparatów hydrożelowych jest ściśle zgodna z równaniem szybkości pierwszego rzędu, ponieważ zarówno hydrożele PF127 obciążone kwasem galusowym, jak i hydrożele PF127/TMC/PEG-HA wykazują wartości R2 równe 0,990, które są wyższe niż te uzyskane z innych modeli szybkości stosowanych w tym badaniu. Szybkość uwalniania leku z hydrożeli zależy zatem od początkowego stężenia leku załadowanego do hydrożeli. Jak wynika z tabeli 2, k1 (sek-1) jest niższe niż inne stałe szybkości dla obu odmian hydrożeli, a zatem trwałe uwalnianie leku z hydrożeli jest bardziej zgodne z modelem szybkości pierwszego rzędu niż z jakimkolwiek innym modelem szybkości zastosowanym w niniejszej pracy.