Effect of Orally Administered Atractylodes macrocephala Koidz Water Extract on Macrophage and T Cell Inflammatory Response in Mice

Abstract

Kłącze Atractylodes macrocephala Koidz (AM) jest składnikiem różnych receptur mieszanek wzmacniających Qi. Ocenialiśmy odpowiedzi zapalne w makrofagach i komórkach T wyizolowanych od myszy po doustnym podaniu wodnego ekstraktu AM (AME). Komórki wysięku otrzewnowego zostały wyizolowane od myszy, którym wstrzyknięto tioglikolan i zbadano zmiany w receptorach wymiataczy. Makrofagi otrzewnowe stymulowano lipopolisacharydem (LPS). Oceniano również odpowiedź cytokinową surowicy na dootrzewnową iniekcję LPS. Izolowano splenocyty i mierzono ich skład oraz odpowiedzi czynnościowe. Zawartość atractylenolidu I i atractylenolidu III, znanych składników przeciwzapalnych, w AME wynosiła odpowiednio 0,0338 mg/g ekstraktu i 0,565 mg/g ekstraktu. AME zwiększało liczbę komórek SRA(+)CD11b(+) w odpowiedzi na tioglikolan. Makrofagi otrzewnowe izolowane z grupy AME nie wykazywały zmian w markerach zapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworów (TNF-) α, interleukina (IL-) 6, indukowana syntaza tlenku azotu i cyklooksygenaza-2, ale wykazywały spadek ekspresji CD86. Co ciekawe, AME obniżyło poziom TNF-α i IL-6 w surowicy po dootrzewnowym podaniu LPS. W odniesieniu do adaptacyjnego układu odpornościowego, AME zwiększało populację komórek T CD4(+) i ekspresję cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II w śledzionie, a hodowane splenocyty z grupy AME wykazywały zwiększoną produkcję IL-4 przy jednoczesnym zmniejszeniu produkcji interferonu-γ podczas aktywacji komórek T. AME promował uzupełnianie makrofagów otrzewnowych podczas odpowiedzi zapalnej, ale jego aktywność przeciwzapalna nie wydawała się być pośredniczona przez modulację aktywności makrofagów. AME zmieniało również status immunologiczny komórek CD4 T, promując odpowiedź Th2.

1. Wstęp

Zapalenie jest odpowiedzią ochronną, mającą na celu eliminację szkodliwych bodźców, a komórki odpornościowe są głównymi uczestnikami tego procesu. W zależności od sposobu rozpoznawania antygenów i zdolności do generowania odpowiedzi pamięciowej, komórki odpornościowe dzieli się na wrodzony układ odpornościowy i adaptacyjny układ odpornościowy. Komórki odporności wrodzonej, takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne, reagują natychmiast na antygen z ograniczoną swoistością receptora. Adaptacyjne komórki odpornościowe, składające się z limfocytów T i komórek B, są swoiste dla antygenów, inicjują odpowiedź na antygen, który dostał się do obwodowej tkanki limfoidalnej i generują odpowiedź pamięciową. Wrodzone komórki odpornościowe są głównymi graczami we wczesnych stadiach zapalenia, ale z czasem przejmują je adaptacyjne komórki odpornościowe.

Makrofagi rezydujące w tkankach odgrywają kluczową rolę w odporności i integralności tkanek. Większość makrofagów tkankowych wywodzi się z prekursorów embrionalnych. W warunkach stanu ustalonego ich populacje są utrzymywane dzięki długowieczności i lokalnej proliferacji, a niektóre makrofagi są uzupełniane przez komórki pochodzące z monocytów krwi. Podczas zapalenia, monocyty pochodzące ze szpiku kostnego są rekrutowane do danego miejsca i różnicują się w makrofagi. Makrofagi eliminują patogeny i antygeny poprzez fagocytozę i wywołują reakcje zapalne poprzez produkcję cytokin i enzymów, takich jak czynnik martwicy nowotworów (TNF-) α, interleukina (IL-) 6, indukowana syntaza tlenku azotu (iNOS) i cyklooksygenaza (COX-) 2. Ponadto makrofagi są jednym z typów profesjonalnych komórek prezentujących antygen (APCs), które prezentują antygeny komórkom T. Komórki T, które składają się głównie z komórek T CD4 i komórek T CD8, są aktywowane, gdy receptory komórek T (TCRs) kontaktują się z peptydami antygenowymi związanymi przez cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) na APCs. Komórki T CD4, które stanowią ponad dwie trzecie komórek T, mogą być różnicowane w różne efektorowe komórki pomocnicze T (Th), takie jak Th1, Th2, Th17, pomocnicze komórki pęcherzykowe T i komórki regulatorowe T . Wśród tych podzbiorów, komórki Th1 i Th2 były pierwszymi typami, które zostały zdefiniowane. Komórki Th1 wydzielają wysoki poziom interferonu- (IFN-) γ i są skuteczne w obronie przed patogenami wewnątrzkomórkowymi poprzez aktywację makrofagów, podczas gdy komórki Th2 wydzielają interleukinę- (IL-) 4, IL-5 i IL-13 i chronią gospodarza przed infekcją helmintami poprzez rekrutację eozynofilów i komórek tucznych. Chociaż te komórki pomocnicze T są ważne dla obrony gospodarza, przewlekła aktywacja każdego typu komórek Th może powodować zaburzenia immunologiczne. Komórki Th1 odgrywają kluczową rolę w narządowo-swoistej autoimmunizacji i przewlekłych zaburzeniach zapalnych, a komórki Th2 są odpowiedzialne za zapalenie alergiczne.

Kłącze Atractylodes macrocephala Koidz (AM), należące do Compositae, było stosowane w leczeniu zaburzeń czynnościowych układu pokarmowego, takich jak utrata apetytu, rozdęcie brzucha i biegunka. Zgodnie z tradycyjną medycyną chińską, AM pobudza Qi poprzez rozwiązywanie problemów związanych z nieprawidłowym zatrzymywaniem płynów w przewodzie pokarmowym. AM jest składnikiem różnych recept na mieszanki pobudzające Qi. W tradycyjnej medycynie chińskiej, jedną z podstawowych funkcji Qi jest obrona. Z tego powodu uważa się, że zioła podnoszące Qi wzmacniają układ odpornościowy. Ponieważ zioła pobudzające qi są przyjmowane zapobiegawczo w celu poprawy stanu odporności u osób bez jawnych defektów, konieczne jest zbadanie, jak układ odpornościowy może się zmieniać u normalnych osób po podaniu AM. Pomimo częstego stosowania AM, przeprowadzono niewiele badań nad wpływem AM na układ odpornościowy.

AM zawiera kilka bioaktywnych seskwiterpenoidów, takich jak atractylenolide I, atractylenolide II i atractylenolide III oraz poliacetyleny. Poddanie makrofagów in vitro działaniu atraktylenolidu I, atraktylenolidu III i niektórych związków poliacetylenowych hamowało indukowaną lipopolisacharydem (LPS) ekspresję TNF-α i iNOS. Doustne podawanie tych rozpuszczalnych w tłuszczach składników wykazało działanie przeciwzapalne u myszy. Jednakże, większość tradycyjnych preparatów ziołowych to wywary na bazie wody, co skutkuje niską wydajnością farmakologicznie aktywnych składników rozpuszczalnych w lipidach. Ponadto, poliacetyleny mogą być łatwo zniszczone we wrzącej wodzie. W związku z tym chcieliśmy sprawdzić, czy w makrofagach izolowanych od myszy, którym podawano AM wyekstrahowaną we wrzącej wodzie (AME), występują odpowiedzi przeciwzapalne. Zbadaliśmy również wpływ AME na odpowiedź zapalną w surowicy krwi. Wreszcie, zbadaliśmy skład i odpowiedź funkcjonalną splenocytów pod kątem jakichkolwiek zmian w adaptacyjnym układzie odpornościowym po suplementacji AME.

2. Materiały i Metody

2.1. Preparation of Sample

AM pochodzący z Eusung (Korea Południowa) został zakupiony od E-Pulip Co., Ltd. (Lot. EPL1356>

2.2. (Lot. EPL1356-4) (Seul, Korea Południowa). Okaz (# 2013-AM) został zdeponowany w Laboratorium Immunologii Ziół, Kyung Hee University. W skrócie, 100 g próbki zmielono, ekstrahowano 1 L wody dejonizowanej (DW) w aparacie zwrotnym i płaszczu grzejnym przez 2 h w 95°C, a następnie przefiltrowano przez bibułę filtracyjną Whatman numer 2 (Whatman International, Kent, Anglia). Ekstrakt zatężono przy użyciu wyparki obrotowej i liofilizowano w próżni. Wydajność AME wynosiła 37,7%. Do analizy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) 0,4 g AME rozpuszczono w 10 ml DW i poddawano sonikacji przez 5 min w temp. 25°C. Ekstrakt dodano do octanu etylu, wstrząsano w celu wymieszania i odstawiono na 1 min. Górną warstwę octanu etylu przeniesiono i procedurę tę powtórzono trzykrotnie. Końcową warstwę octanu etylu zatężono i liofilizowano.

2.2. HPLC

Próbki analizowano za pomocą systemu HPLC z odwróconą fazą (Shimadzu 20A, Kyoto, Japonia), który składał się z autosamplera (SIL-20A), pompy binarnej (LC-20AD) i detektora z matrycą fotodiodową (SPD-20A) i był wyposażony w kolumnę YMC-Triart C18 (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Japonia). Przepływy gradientowe dla układu dwóch rozpuszczalników (rozpuszczalnik A, 0,05% kwas fosforowy w wodzie; rozpuszczalnik B, acetonitryl) były następujące: 85% A/15% B w 0 minucie, 85% A/15% B w 5 minucie, 50% A/50% B w 15 minucie, 50% A/50% B w 20 minucie, 40% A/60% B w 25 minucie, 40% A/60% B w 30 minucie, 15% A/85% w 35 minucie, 15% A/85% w 40 minucie, 85% A/15% w 42 minucie i 85% A/15% w 45 minucie. Szybkość przepływu fazy ruchomej wynosiła 1,0 ml/min, a objętość wstrzyknięcia 10 μl. Detekcję przeprowadzono przy 220 nm dla atraktylenolidu III (Sigma, St. Louis, MO, USA) lub przy 280 nm dla atraktylenolidu I (Sigma).

2.3. Zwierzęta

Siedmiotygodniowe samce myszy Balb/c uzyskano od SamTaco (Osan, Korea Południowa) i umieszczono w obiekcie dla zwierząt wolnym od patogenów, o kontrolowanej temperaturze i wilgotności, z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność. Wszystkie zwierzęta poddano tygodniowej adaptacji przed rozpoczęciem doświadczeń. Dawki określono przy użyciu obliczeń ekstrapolowanych na podstawie różnicy w powierzchni ciała myszy i człowieka. Zalecana dawka AM dla dorosłego człowieka o masie ciała 60 kg wynosi 8-24 g surowej rośliny dziennie lub 3-9 g ekstraktu dziennie (w oparciu o wydajność ekstrakcji w tym badaniu). Dawka dla myszy może być określona w następujący sposób: dawka równoważna dla człowieka 50-150 mg/kg × 12,3 (współczynnik konwersji) = dawka dla myszy 615-1,845 mg/kg. W oparciu o ten zakres dawek, wybraliśmy dawki 500 mg/kg i 2,500 mg/kg do tego badania. Zwierzęta zostały losowo przydzielone do grup doświadczalnych. AME podawano przez zgłębnik doustny raz dziennie przez 10 dni. Nie stwierdzono różnic w masie ciała pomiędzy grupami podczas okresu doświadczalnego. Protokół zwierzęcy został zatwierdzony przez Institutional Animal Care and Use Committee na Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-012), a myszy były pielęgnowane zgodnie ze specyfikacją US National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals (1996).

2.4. Przygotowanie makrofagów

Do izolacji makrofagów myszom wstrzykiwano dootrzewnowo 2 ml 3,5% sterylnego tioglikolanu (BD, Sparks, MD, USA) na 4 dni przed uśmierceniem. Pod koniec eksperymentu myszy uśmiercano przez wyparcie szyjki macicy, a komórki wysięku otrzewnowego izolowano aseptycznie przez płukanie otrzewnej zimnym DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS; Hyclone) i 1% penicylinę-streptomycynę. Po odwirowaniu, komórki zostały ponownie zawieszone i policzone przy użyciu licznika komórek TC20 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.5. Przygotowanie splenocytów

Do izolacji splenocytów śledziony uzyskano aseptycznie pod koniec doświadczenia. Po rozbiciu śledziony między szklanymi szkiełkami w RPMI 1640 (Hyclone) z 1% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną, komórki były filtrowane przez sitko komórkowe 70 μm. Po odwirowaniu, czerwone krwinki były lizowane przy użyciu buforu lizującego BD PharmLyse (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Komórki zostały ponownie zawieszone w RPMI 1640 z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną i policzone przy użyciu licznika komórek T20.

2.6. Dootrzewnowe wstrzyknięcie LPS

Myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 1,3 mg/kg LPS (serotyp 055:B5, Sigma) pod koniec doświadczenia. Po 1 h myszy były znieczulane eterem, a krew pobierano przez nakłucie serca. Uzyskano surowicę i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu analizy.

2.7. Hodowla komórek

Komórki wysięku otrzewnowego umieszczano na płytkach 6-dołkowych lub 60-mm płytkach i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Po usunięciu nie przylegających komórek, przyłączone komórki stymulowano 100 ng/ml LPS przez 24 h. Supernatant i komórki zbierano do kolejnych oznaczeń. Splenocyty umieszczano na płytkach z 24 dołkami i stymulowano przeciwciałem anty-CD3 2 μg/ml (BD Biosciences) przez 48 h. Supernatant zbierano do analizy cytokin.

2.8. Cytometria przepływowa

Komórki przemywano dwukrotnie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie zawieszano w ilości 1 × 106 komórek/ml w buforze FACS (PBS/0,1% NaN3/1% FBS). Komórki blokowano przeciwciałem szczurzym anty-mysim CD16/CD32 (BD Biosciences) w 4°C przez 5 min, a następnie barwiono przeciwciałem anty-mysim SR-AI sprzężonym z fluoresceiną, przeciwciałem anty-mysim LOX1 sprzężonym z PE (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), przeciwciałem anty-mysim CD36 sprzężonym z PE, FITC-koniugowany CD11b, PE-koniugowany anty-CD11b, PE-koniugowany anty-mouse CD86, FITC-koniugowany anty-mouse CD4, PE-koniugowany anty-mouse CD8a, FITC-koniugowany anty-mouse CD19 i FITC-koniugowany anty-mouse IA/IE (BD Biosciences) (wszystkie przeciwciała były rozcieńczone 1:100) przez 30 min na lodzie w ciemności. Dopasowane przeciwciała izotypowe były używane do wykazania wiązania niespecyficznego. Komórki zostały wypłukane i ponownie zawieszone w buforze FACS. Na cytometrze przepływowym Navios (Beckman Coulter, La Brea, CA, USA) uzyskano w sumie 10 000 zdarzeń, a dane przetworzono przy użyciu oprogramowania Kaluza (Beckman Coulter).

2.9. Cytokine Analysis

The levels of TNF-α, IL-6, IFN-γ, and IL-4 in supernatants and sera were determined using BD OptEIA mouse ELISA sets (BD Biosciences) according to the manufacturer’s protocol.

2.10. Proliferation Assay

Splenocyty (4 × 105) w płytkach 96-dołkowych stymulowano rozpuszczalnym mAb anty-CD3 (2 μg/ml) przez 48 h. Proliferację komórek określano przy użyciu zestawu do badania proliferacji komórek CellTiter96 One Solution (Promega, Madison, WI, USA).

2.11. Izolacja RNA i Real-Time PCR

Totalne RNA izolowano przy użyciu FavorPrep Total RNA Purification Kit (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan), a cDNA poddawano odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu High Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Rozcieńczone cDNA mieszano z Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) i 2 pmol starterów specyficznych dla iNOS, COX2 lub GAPDH. Amplifikację cDNA przeprowadzono przy użyciu systemu StepOnePlus real-time PCR (Applied Biosystems). Po wstępnej denaturacji w temperaturze 95°C przez 10 min, warunki PCR ustawiono na 95°C przez 15 sek. i 60°C przez 1 min. przez 40 cykli. Do każdego PCR dołączano odpowiednią próbkę mRNA bez odwrotnej transkrypcji jako kontrolę negatywną. Kwantyfikacja liczby kopii cDNA została uzyskana przy użyciu krzywej standardowej.

2.12. Analiza statystyczna

Dane zostały przedstawione jako średnia, błąd standardowy średniej (SEM). Do porównania różnic między grupami zastosowano dwustronny test t-Studenta lub dwukierunkową analizę wariancji. Jeśli analiza statystyczna wykazała, że różnice między wieloma grupami były istotne, do dalszych porównań stosowano test post hoc Tukeya. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania IBM SPSS 22.0 (IBM, Chicago, IL, USA). Wartości P mniejsze niż 0,05 uznawano za istotne.

3. Wyniki

3.1. Content of Atractylenolide I and Atractylenolide III in AME

Wśród znanych markerów kontroli jakości, atractylenolid I i atractylenolid III są zweryfikowanymi związkami przeciwzapalnymi in vitro . Frakcja octanu etylu z AME została wstępnie zidentyfikowana przy użyciu spikowanego wkładu autentycznych wzorców z porównaniem czasów retencji i wzorców spektralnych UV-visible. Chromatogramy HPLC przedstawiono na rysunku 1. Zawartość atraktylenolidu I i atraktylenolidu III w AME wynosiła odpowiednio 0,0338 mg/g ekstraktu i 0,565 mg/g ekstraktu.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. Effect of Oral Administration of AME on Scavenger Receptor Expression in Mouse Peritoneal Exudate Cells

Intraperitoneal injection of thioglycollate is commonly used to induce sterile peritonitis and enrich peritoneal macrophages from mice in laboratories . Większość makrofagów otrzewnowych pochodzi z monocytów krwi. Zebraliśmy komórki wysięku otrzewnowego od myszy leczonych AME za pomocą tej metody. CD11b był używany jako marker dla makrofagów. Receptory Scavengera, takie jak SRA, CD36 i LOX-1, są wyregulowane podczas różnicowania monocytów w makrofagi; dlatego zbadaliśmy ekspresję tych białek. SRA, CD36 i LOX-1 ulegały ekspresji prawie wyłącznie w komórkach CD11b(+) (ryc. 2(a)-2(c)). Odsetek komórek SRA(+)CD11b(+) w grupie kontrolnej wynosił 66%, a leczenie za pomocą 500 mg/kg i 2,500 mg/kg AME znacząco zwiększyło tę populację odpowiednio do 69% i 76%. Częstość występowania populacji komórek CD36(+)CD11b(+) i LOX-1(+)CD11b(+) w grupie kontrolnej wynosiła odpowiednio 95% i 14%, a AME nie powodował istotnych zmian w obu populacjach. Wzrost populacji komórek SRA(+)CD11b(+) wskazuje, że AME może stymulować różnicowanie monocytów krwi w makrofagi w odpowiedzi na tioglikolan.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

3.3. Effect of Oral Administration of AME on Surface CD86 Expression in LPS-Stimulated Macrophages

Cząsteczki kostymulujące, takie jak CD86 na makrofagach, są wymagane w celu wzmocnienia kontaktu między makrofagami i komórkami Th. Makrofagi otrzewnowe izolowane od myszy leczonych AME były stymulowane LPS przez 24 h, a ekspresja błonowa CD86 była mierzona za pomocą cytometrii przepływowej. Stymulacja LPS zwiększyła średnią intensywność fluorescencji CD86 z 5,24 do 11,24 (Figura 3). Średnia intensywność fluorescencji CD86 w grupach 500 i 2500 mg/kg znacznie się zmniejszyła, odpowiednio do 10,14 i 10,59. Wyniki te wskazują, że AME może wpływać na interakcję między makrofagami i komórkami Th.

(a)

(b)

(a)
(b)

3.4. Effects of Oral Administration of AME on the Inflammatory Cytokine Response in Macrophages and Serum

W pierwszej kolejności zbadaliśmy, czy doustne podawanie AME wpływa na odpowiedź zapalną makrofagów. Makrofagi otrzewnowe z grupy kontrolnej lub grupy otrzymującej duże dawki AME były stymulowane LPS przez 24 h i mierzono produkcję TNF-α i IL-6 w supernatancie. Nie było różnicy w poziomie wydzielania TNF-α między grupą kontrolną a grupą AME, ale poziom IL-6 był zwiększony w grupie AME (Figura 4(a)). Stwierdziliśmy również, że AME nie wywołuje żadnych zmian w ekspresji genów iNOS i COX-2 w komórkach stymulowanych LPS (Rysunek 4(b)). Następnie zbadaliśmy ogólnoustrojową odpowiedź myszy leczonych AME na dootrzewnową stymulację LPS. AME obniżył poziom TNF-α i IL-6 w surowicy odpowiednio o 20% i 47% (Figura 5). Wyniki te wskazują, że aktywność przeciwzapalna AME może występować niezależnie od modulacji makrofagów.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Rycina 4

Wpływ AME na cytokiny zapalne i enzymy w makrofagach stymulowanych LPS-.stymulowanych makrofagów. Makrofagi wyizolowane z grupy kontrolnej lub grupy AME (2500 mg/kg) stymulowano LPS (100 ng/ml) przez 24 h. (a) Poziomy czynnika martwicy nowotworów (TNF-) α i interleukiny (IL-) 6 w supernatancie oznaczono metodą ELISA. (b) Ilościowy PCR został użyty do pomiaru ekspresji genów iNOS i COX-2. Ekspresja genów docelowych została znormalizowana do ekspresji GAPDH. Dane przedstawiają średnią ± SEM (n=6). (-): bez LPS, (+): leczenie LPS. # P<0,005 w porównaniu z kontrolą (-), P<0,05 w porównaniu z kontrolą (+).

Rycina 5

Wpływ doustnego podawania AME na reakcje zapalne w surowicy po dootrzewnowym wstrzyknięciu LPS. AME (2500 mg/kg) podawano doustnie myszom przez 10 dni. Surowicę uzyskano 1 h po dootrzewnowym wstrzyknięciu LPS (1,3 mg/kg), a stężenie TNF-α i IL-6 w surowicy oznaczono metodą ELISA. Dane przedstawiają średnią ± SEM (n=10). (-): bez LPS, (+): leczenie LPS. # P<0,001 w porównaniu z kontrolą (-), P <0,05, P <0,001 w porównaniu z kontrolą (+).

3.5. Effects of Oral Administration of AME on Splenic T Cell and B Cell Populations and MHC II Expression

Aby określić, czy doustne podawanie AME zmienia adaptacyjne komórki odpornościowe, przeanalizowaliśmy odsetek komórek T i B w śledzionie CD4 i CD8 w grupach kontrolnych i AME. Populacja komórek T CD4(+) znacząco wzrosła z 23,4% do 27,2% i 26,9% odpowiednio w grupach 500 i 2,500 mg/kg (Ryc. 6(a) i 6(d)). Nie zaobserwowano różnic w populacjach komórek T CD8 i komórek B (rysunki 6(a), 6(b) i 6(d)). Cząsteczki MHC klasy II są niezbędne do prezentacji antygenów komórkom T CD4. Przeanalizowaliśmy ekspresję mysich cząsteczek MHC klasy II IA/IE w śledzionie i stwierdziliśmy, że średnia intensywność fluorescencji cząsteczek MHC II znacząco wzrosła z 65,3 do 68,9 w grupie AME 2,500 mg/kg (Figury 6(c) i 6(e)). Wyniki te sugerują, że AME wywołuje zmiany w adaptacyjnym układzie odpornościowym.

(a)

(b)

.
(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Rycina 6

Wpływ doustnego podawania AME na skład adaptacyjnego układu odpornościowego w śledzionie. Splenocyty izolowano z grupy kontrolnej lub grupy AME i dwukrotnie barwiono przeciwciałem anty-CD4 sprzężonym z FITC i przeciwciałem anty-CD8 sprzężonym z PE (a), przeciwciałem anty-CD19 sprzężonym z FITC (b) lub przeciwciałem anty-MHC II sprzężonym z FITC (c) i oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. (a-c) Pokazano reprezentatywne dot bloty lub histogramy. (d-e) Słupki przedstawiają średnią±SEM (n=6). P <0,001 w porównaniu z kontrolą.

3.6. Effects of Oral Administration of AME on T Cell Proliferation and Th1/Th2 Cytokine Response in Splenocytes

Badano funkcję komórek T śledziony po podaniu AME. Splenocyty wyizolowane z grup kontrolnych lub AME stymulowano przeciwciałem anty-CD3, mitogenem, który aktywuje całą populację komórek T niezależnie od swoistości receptora antygenowego. Traktowanie przeciwciałem anty-CD3 przez 48 h zwiększało gęstość optyczną 2,6-krotnie, mierzoną testem MTS. Nie było różnicy w proliferacji indukowanej przez przeciwciało anty-CD3 między grupą kontrolną a grupą AME (Figura 7(a)). IFN-γ i IL-4 są cytokinami reprezentatywnymi dla komórek Th1 i Th2, odpowiednio. Ocenialiśmy wydzielanie IFN-γ i IL-4 w splenocytach stymulowanych przeciwciałem anty-CD3. Znaczne zmniejszenie wydzielania IFN-γ obserwowano w grupie 500 mg/kg AME, podczas gdy wydzielanie IL-4 było znacznie zwiększone w grupie 2,500 mg/kg (Figura 7(b)). Chociaż nie zaobserwowano efektu zależnego od dawki, AME wykazywał tendencję do promowania odpowiedzi Th2.

(a)

(b)

(a)
(b)

4. Dyskusja

W tradycyjnej medycynie chińskiej oczekuje się, że zioła zwiększające Qi wzmocnią układ odpornościowy. W tym badaniu skupiliśmy się szczególnie na odpowiedzi zapalnej makrofagów i komórek T wyizolowanych od myszy, którym podano doustnie AME.

Thioglikolat indukowany sterylnym zapaleniem otrzewnej został po raz pierwszy wprowadzony w 1964 roku przez Gallily i wsp. i od tego czasu jest najczęściej stosowaną metodą izolacji pierwotnych makrofagów. W 4. dniu po dootrzewnowym podaniu tioglikolanu całkowita liczba komórek wysięku otrzewnowego wzrasta około 5-krotnie. Wśród tych komórek dominującym typem komórek są makrofagi, a następnie eozynofile. Źródłem zwiększonej liczby makrofagów otrzewnowych u myszy, którym wstrzyknięto tioglikolan, są monocyty krwi pochodzące ze szpiku kostnego. Upregulation of scavenger receptors occurs during the process of monocyte-to-macrophage differentiation . Receptory scavengera, jeden z typów wrodzonych receptorów makrofagów, są odpowiedzialne za fagocytozę i specyficznie rozpoznają ligandy polianionowe. Użyliśmy CD11b i kilku markerów receptorów scavengera do identyfikacji makrofagów pochodzących z monocytów w komórkach wysięku otrzewnowego i stwierdziliśmy, że populacja komórek CD11b(+)SRA(+) była znacząco zwiększona w grupie AME. Sugeruje to, że podawanie AME promuje rekrutację i różnicowanie monocytów krwi do makrofagów w odpowiedzi na tioglikolan.

LPS jest rozpoznawany przez kompleks receptora toll-podobnego (TLR)-4/MD-2. TLR4 indukuje odpowiedź zapalną poprzez dwie cząsteczki adaptorowe, MyD88 i TRIF . Ścieżka sygnałowa zależna od MyD88 aktywuje NF-κB i kinazę białkową aktywowaną mitogenami (MAPK), aby wywołać geny zapalne, takie jak TNF-α i IL-6. Ścieżka sygnałowa zależna od TRIF aktywuje czynnik regulacyjny interferonu-3 do produkcji IFN-β, który jest wymagany do upregulacji cząsteczek kostymulacyjnych. Szlak sygnalizacyjny TRIF uczestniczy również w aktywacji NF-κB i MAPK, ale w sposób opóźniony w stosunku do szlaku zależnego od MyD88. Upregulation of costimulatory molecules is solely TRIF-dependent while inflammatory responses are co-dependent on MyD88 and TRIF . W makrofagach z grupy AME nie zaobserwowano hamującego wpływu na badane markery stanu zapalnego. Zmniejszona była natomiast ekspresja CD86. CD86 na makrofagach wiąże się z CD28 na komórkach Th w celu wzmocnienia aktywności komórek Th. Nasze wyniki wskazują, że doustne podawanie AME nie wpływa na zależną od NF-κB- i MAPK odpowiedź zapalną w makrofagach, ale specyficznie zakłóca zależną od TRIF ścieżkę, która prowadzi tylko do ekspresji CD86. Konieczne są dalsze badania, aby ocenić, czy AME powoduje zmiany w sytuacji patologicznej, w której dominują makrofagi i komórki Th.

System makrofagów stymulowanych LPS jest bardzo powszechnym modelem in vitro do oceny aktywności przeciwzapalnej produktów naturalnych lub kandydatów na leki. Używając tego modelu, łatwo jest uzyskać pożądany rezultat przy użyciu składników rozpuszczalnych w lipidach, ponieważ mogą one łatwo przeniknąć przez błonę komórkową. Nasze dane wykazały, że makrofagi otrzewnowe izolowane od myszy, którym podano doustnie AME, nie wykazywały działania przeciwzapalnego ex vivo, zaprzeczając wcześniejszym doniesieniom o wynikach in vitro. Przeciwnie, aktywność przeciwzapalna AME była obserwowana w odpowiedzi surowicy na TNF-α i IL-6 po dootrzewnowym wstrzyknięciu LPS. Ta ogólnoustrojowa aktywność przeciwzapalna jest najmniej prawdopodobne, że jest pośredniczona przez modulację makrofagów. Jedną z różnic między warunkami in vivo i in vitro jest to, że LPS jest przenoszony w krążeniu przez kilka lipoprotein, a następnie usuwany przez hepatocyty in vivo, podczas gdy tego zdarzenia nie można naśladować in vitro . Usuwanie LPS może zapobiegać nadmiernej stymulacji makrofagów wątrobowych. Pozostaje do ustalenia, czy ogólnoustrojowe działanie przeciwzapalne AME jest związane z klirensem LPS w wątrobie. Podobny wynik uzyskano w makrofagach otrzewnowych izolowanych od myszy, którym podawano doustnie wodny ekstrakt Astragalus membranaceus (dane niepublikowane). Astragalus membranaceus i AM należą do tej samej kategorii ziół tonizujących Qi. W tym momencie nie wiemy, czy aktywność przeciwzapalna in vivo, która nie obejmuje modulacji makrofagów jest unikalna dla tych roślin leczniczych, czy jest to wspólna właściwość indukowana przez rośliny lecznicze tonizujące Qi, i musimy zgromadzić więcej danych, aby wyciągnąć jakiekolwiek wnioski. Ponadto Li i wsp. donieśli, że atractylenolide I i 14-acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, rodzaj związku poliacetylenowego wyizolowanego z AM, mają strukturę molekularną, która oddziałuje z receptorem glukokortykoidowym związanym z błoną. Według ich badań, 300 mg/kg doustnie podanego atractylenolidu I i 30 mg/kg doustnie podanego poliacetylenu były minimalnymi dawkami wymaganymi do wykazania działania przeciwzapalnego. Ilość atraktylenolidu I w 2,500 mg/kg AME wynosi zaledwie 0,097 mg/kg, co stanowi dawkę znacznie poniżej wymaganego minimum. Ponadto podczas przygotowywania AME musiała nastąpić utrata poliacetylenów. Możliwe jest, że AME zawiera niezidentyfikowane związki podobne do glukokortykoidów, które przyczyniają się do jego ogólnoustrojowej aktywności przeciwzapalnej.

Dostateczna liczba komórek T jest wymagana do utrzymania prawidłowej odpowiedzi immunologicznej. W normalnych warunkach całkowita liczba komórek T jest utrzymywana przez wytwarzanie naiwnych komórek T w grasicy oraz obrót obwodowych naiwnych komórek T i komórek T pamięci. U myszy i ludzi wraz z wiekiem dochodzi do zaniku grasicy i w związku z tym u obu gatunków zmniejsza się produkcja komórek T naiwnych. Jednakże, jeśli chodzi o utrzymanie naiwnych komórek T, myszy produkują naiwne komórki T przez całe życie, podczas gdy dorośli ludzie utrzymują tę populację poprzez obwodowe podziały naiwnych komórek T . Ponadto, czas życia mysich naiwnych komórek T jest 40-krotnie krótszy niż ich ludzkich odpowiedników. Komórki T pamięci są utrzymywane przez przerywany podział. Dokładny mechanizm przeżycia i homeostatycznej proliferacji naiwnych i pamięciowych komórek T nie jest w pełni zdefiniowany, ale obejmuje sygnały z kompleksu TCR/MHC i cytokin, takich jak IL-7 i IL-15. Przedłużone działanie szczepionek zależy od komórek T pamięci, podczas gdy leczenie stanów limfopenicznych wymaga komórek T naiwnych. Nie określiliśmy, czy populacja komórek CD4 T śledziony, która wzrosła po leczeniu AME, składała się z naiwnych komórek CD4 T lub komórek CD4 T pamięci. Szczegółowa charakterystyka frakcji komórek odpowiadających na AME pomoże określić, która sytuacja lepiej nadaje się do zastosowania AME.

Of note, concurrent upregulation of MHC class II molecules in the spleen occurred in the AME group. Cząsteczki MHC klasy II są niezbędne do dostarczania antygenów do komórek T CD4. Stwierdziliśmy rutynowo, że większość komórek wykazujących ekspresję MHC klasy II w śledzionie to komórki B, a pozostałe komórki to makrofagi i komórki dendrytyczne. Nie wyjaśniliśmy, które typy komórek wykazywały upregulation cząsteczek MHC klasy II po podaniu AME. Niemniej jednak, wzrost zarówno liczby komórek CD4 T, jak i ekspresji cząsteczek MHC klasy II w śledzionie wskazuje, że suplementacja AME przyczynia się do ogólnoustrojowego utrzymania komórek CD4 T. Rolą IL-4 w warunkach fizjologicznych jest wzmocnienie odpowiedzi przeciwciał poprzez promowanie przeżycia i proliferacji komórek B oraz zapewnienie obrony przed infekcją helmintami. Splenocyty z grup AME wykazywały zwiększoną produkcję IL-4 podczas aktywacji komórek T ex vivo, przy jednoczesnej zmniejszonej produkcji IFN-γ. Wyniki te sugerują, że w normalnych warunkach AME promuje odpowiedź Th2. Z kolei doustne podanie glikoproteiny pochodzącej z AM promuje odpowiedź Th1 przy jednoczesnym zmniejszeniu odpowiedzi Th2 w modelu alergicznym. Nie jest jasne, czy związek ten reprezentuje całą aktywność AM. Konieczne są dalsze badania w celu ustalenia, czy AME zapobiega lub nasila patologiczną odpowiedź Th2.

5. Conclusion

W tym badaniu obserwowaliśmy zmiany w odpowiedziach makrofagów i komórek T u normalnych myszy po doustnym podaniu AME. AME zwiększyło indukowane tioglikolanem różnicowanie monocytów w otrzewnej i zmniejszyło indukowane LPS poziomy TNF-α i IL-6 w surowicy. W przeciwieństwie do tych ogólnoustrojowych efektów przeciwzapalnych, efekty przeciwzapalne nie były widoczne w makrofagach izolowanych z grupy AME, z wyjątkiem zmian w ekspresji cząsteczek kostymulujących. AME wpływał również na adaptacyjny układ odpornościowy poprzez zwiększenie liczby komórek T CD4 i ekspresji cząsteczek MHC klasy II oraz promowanie odpowiedzi Th2 w stosunku do odpowiedzi Th1.

Skróty

Dostępność danych

Dane użyte do poparcia wyników tego badania są dostępne na żądanie od autora odpowiadającego.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez Basic Science Research Program poprzez National Research Foundation of Korea finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2014R1A1A2055052).