W prezentowanym badaniu badaliśmy wpływ ostrego dożylnego obciążenia objętościowego 0.9% soli fizjologicznej, 3% soli fizjologicznej i izotonicznego wlewu glukozy na u-AQP2 i u-ENaCγ w randomizowanym, krzyżowym badaniu zdrowych osób. Celem była ocena aktywności transportu przez kanały wodne akwaporyny 2 i nabłonkowe kanały sodowe w komórkach głównych w dystalnej części nefronu.
Podczas wlewu i w okresie bezpośrednio po nim zachodzą adaptacyjne zmiany fizjologiczne w funkcji nerek i hormonów wazoaktywnych. Można więc oczekiwać, że główne zmiany w zmiennych efektu wystąpią po infuzji. W niniejszym badaniu szczególną uwagę zwrócono na zmiany zmiennych efektu w ostatnim okresie po infuzji (Post infusion 210-240), tj. 60-90 minut po zakończeniu infuzji. W tym okresie u-AQP2 wzrastała po infuzji hipertonicznej i izotonicznej soli fizjologicznej, a malała po infuzji glukozy. W tym samym czasie u-ENaCγ wzrosła po infuzji hipertonicznej soli fizjologicznej i pozostała niezmieniona po infuzji izotonicznej soli fizjologicznej i glukozy.
U-AQP2 po infuzji hipotonicznej i izotonicznej soli fizjologicznej oraz izotonicznej glukozy
Aquaporyna-2 (AQP2) znajduje się w komórkach głównych przewodu zbiorczego i ulega ekspresji w apikalnej błonie plazmatycznej. Wazopresyna (AVP) reguluje AQP2 poprzez wiązanie się z receptorami V2 w błonie podstawnej, . Krótkotrwała ekspozycja na AVP powoduje przemieszczanie się i wprowadzanie wewnątrzkomórkowych pęcherzyków, zawierających AQP2, do błony apikalnej oraz zwiększa przepuszczalność i absorpcję wody. Regulacja długoterminowa występuje w okresie od godzin do dni i jest spowodowana transkrypcją genów regulowaną przez AVP, co powoduje wzrost obfitości AQP2 w całej komórce. Eksperymenty na szczurach wykazały, że infuzja dDAVP zwiększyła u-AQP2 . Jest to zgodne z poglądem, że zwiększone dostarczanie kanałów AQP2 do błony koniuszkowej powoduje zwiększone wydalanie AQP2 po stymulacji AVP. Około 3% AQP2 w przewodzie zbiorczym jest wydalane do moczu, ale podstawowe mechanizmy są nieznane.
Rozszerzenie objętości z 3% solą hipertoniczną zwiększa osmolarność osocza poza próg osmoreceptorów podwzgórza, wyzwalając uwalnianie AVP i następujący wzrost u-AQP2. Saito i wsp. stwierdzili istotną zależność między wydalaniem AQP2 i p-AVP z moczem u osób zdrowych po 5% infuzji soli hipertonicznej. Pedersen i wsp. stwierdzili dodatnią korelację między u-AQP2 i p-AVP podczas 24-godzinnej deprywacji wody i po 3% hipertonicznej infuzji soli. Tak więc, poprzednie badania u ludzi wykazały, że aktywność kanałów wodnych AQP2 może być określona poprzez pomiar u-AQP2 . Co zaskakujące, Baumgartner i wsp. nie stwierdzili zmian w u-AQP2 po infuzji 2,5% NaCl u zdrowych ochotników, pomimo znacznego wzrostu zarówno osmolarności moczu, jak i AVP . Jednakże, doustny ładunek wody był 3-4 razy większy przed infuzją w porównaniu z naszym badaniem. Tak więc, duży ładunek wody przed infuzją mógł zniwelować stymulujące działanie hipertonicznej soli fizjologicznej. Zgodnie z oczekiwaniami, nasze badanie wykazało, że u-AQP2 wzrosła po 3% NaCl z odpowiadającym wzrostem osmolarności moczu i zmniejszeniem CH2O. Tak więc, nasze wyniki wskazują na zwiększoną reabsorpcję wody przez kanały wodne akwaporyny-2 w kanalikach dystalnych. Przed wzrostem u-AQP2 nastąpił gwałtowny wzrost p-osm i p-AVP wywołany hipertonicznym wlewem soli. Badania na zwierzętach wykazały, że hipertoniczność może powodować regulację ekspresji AQP2 w błonie apikalnej porównywalną z tą osiąganą przez sam AVP. Nie można wykluczyć, że może to odgrywać aktywną rolę w zwiększonym wydalaniu u-AQP2. Najprawdopodobniej zwiększona reabsorpcja wody była pośredniczona przez wzrost p-AVP. U-AQP2 nadal wzrastał przez cały dzień badania, sugerując, że kanały AQP2 pozostały wstawione i aktywne w błonie apikalnej z powodu działań podwyższonego p-AVP.
Infuzja izotonicznej soli fizjologicznej deprymuje frakcyjną reabsorpcję wody i soli w kanalikach proksymalnych u zwierząt. W obecnym badaniu infuzja 0,9% NaCl spowodowała taką samą odpowiedź w u-AQP2, u-osm i CH2O jak infuzja 3% NaCl, aczkolwiek w mniejszym stopniu. Nastąpił niewielki wzrost p-osm do maksymalnego poziomu 286 mosmol/kg, co odpowiada wzrostowi o 0,5%. Wzrost ten jest poniżej progu osmoreceptorów i nie zaobserwowaliśmy, ani nie spodziewaliśmy się, żadnej znaczącej zmiany w p-AVP. Dlatego AVP nie może być głównym regulatorem AQP2 podczas działania 0,9% NaCl. Najprawdopodobniej zwiększony transport wody przez AQP2 jest zjawiskiem kompensacyjnym, mającym na celu antagonizowanie spadku nerkowej absorpcji wody w kanalikach proksymalnych, który występuje po izotonicznym rozszerzeniu objętości. Mechanizm ten może wynikać ze zwiększonej aktywności w układzie peptydów natriuretycznych .
Infuzja 5% glukozy powoduje ekspansję objętościową rozłożoną na wszystkie fazy płynu w organizmie z bardzo niewielkim wzrostem objętości osocza. Jest to zilustrowane w pomiarach albumin osocza, gdzie stężenia w 240 min były praktycznie równe linii podstawowej (Tabela 4), wskazując na brak zmian w płynie pozakomórkowym. Zgodnie z naszą wiedzą, w żadnym badaniu nie mierzono u-AQP2 po infuzji glukozy. W badaniu z udziałem zdrowych osób wykazano, że po doustnym podawaniu wody w ilości 20 mL/kg przez 15 minut (średnie spożycie 1605 ml) u-AQP2 zmniejszyła się o 17% po 210 minutach. W jednym z ostatnich badań u osób poddanych doustnemu obciążeniu wodą w ilości 20 ml/kg przez 15 minut (średnie spożycie 1389 ml) nastąpił 27% spadek u-AQP2 po 240 minutach. Zarówno osmolarność osocza, jak i p-AVP uległy zmniejszeniu. Tak więc wykazano, że u-AQP2 jest zmniejszona podczas diurezy wodnej po doustnym przyjęciu wody .
W naszym badaniu, uczestnicy otrzymali średnio 1736 ml glukozy IV. W ostatnim okresie po infuzji wystąpiła oczekiwana odpowiedź aquaretyczna, z 16% spadkiem u-AQP2cr, spadkiem u-osm i wzrostem UO i CH2O. Osmolarność osocza zmniejszyła się z 285 mosm/kg do 280 m0sm/kg, tj. o 2%, ale bez towarzyszącego zmniejszenia p-AVP. Nasze wyniki wskazują na zmniejszoną reabsorpcję wody przez kanały wodne akwaporyny-2 w kanalikach dystalnych po izotonicznym wlewie glukozy. Brak zmian w p-AVP można po pierwsze wytłumaczyć faktem, że badani otrzymali 1225 ml doustnego ładunku wody przed rozpoczęciem wlewu, co mogło spowodować supresję AVP w okresie wyjściowym. Po drugie, pomiary stężenia p-AVP mogą nie być wystarczająco czułe, aby wykryć niewielki spadek. Ostatnio odkryty peptyd Apelin, może również odgrywać rolę. Apelina jest kolozowana z AVP w neuronach magnokomórkowych podwzgórza. U zdrowych ochotników płci męskiej zmniejszenie osmolarności osocza przez obciążenie wodą zmniejszyło p-AVP umiarkowanie, ale p-Apelina wzrosła gwałtownie. Regulacja apeliny jest przeciwna do regulacji AVP i dane sugerują, że apelina, podobnie jak AVP, może uczestniczyć w regulacji homeostazy wodnej. Nie mierzyliśmy p-Apeliny, ale mogłoby być interesujące zbadanie apeliny osocza równolegle z p-AVP w warunkach różnych ekspansji objętości.
Tak więc, w ostatnim okresie po-infuzyjnym, u-AQP2 wzrosła w przybliżeniu w tym samym stopniu po hipertonicznym i izotonicznym wlewie soli, podczas gdy wyraźny spadek był widziany po izotonicznym wlewie glukozy. Możliwym wyjaśnieniem opóźnienia w zmianach u-AQP2 może być to, że trwa kilka minut, aby zmiany w AVP działały na komórkę główną, albo przez wstawienie lub usunięcie AQP2 z błony apikalnej, ale trwa kilka minut, zanim efekt jest widoczny w wydalaniu u-AQP2 w moczu.
U-ENaCγ po infuzji hipotonicznej i izotonicznej soli fizjologicznej oraz izotonicznej glukozy
Transport sodu przez przewód zbiorczy odbywa się przez nabłonkowy kanał sodowy i jest odpowiedzialny za reabsorpcję 3-5% filtrowanego sodu. ENaC składa się z trzech odrębnych podjednostek: α, β i γ i zlokalizowany jest na apikalnej błonie plazmatycznej komórek głównych. ENaC jest celem aldosteronu, który działa na receptor mineralokortykoidowy. Aldosteron zwiększa transport sodu poprzez redystrybucję podjednostek ENaC z miejsc wewnątrzkomórkowych do błony apikalnej, jak również zmienia transkrypcję genów. Podczas gdy działanie aldosteronu występuje w ciągu godzin lub dni, inna synergistyczna ścieżka obejmuje AVP . W korowych przewodach zbiorczych u szczurów, AVP wiąże się z receptorami V2, stymuluje cAMP i zwiększa reabsorpcję sodu poprzez promowanie trafficking i insertion ENaC do błony apikalnej indukując szybką zmianę w aktywności kanału. Ostatnie badania u ludzi wykazały, że AVP, poprzez receptory V2, stymuluje pośredniczoną przez ENaC reabsorpcję sodu przez komórki główne .
Frakcje ENaC są normalnie wydalane do moczu. Ilość ENaC-frakcji ma odzwierciedlać aktywność transportu sodu przez nabłonkowe kanały sodowe tak jak u-AQP2 odzwierciedla funkcjonalny status kanałów wodnych AQP2. Ostatnio nasza grupa wprowadziła nową metodę oceny reabsorpcji sodu w komórkach głównych kanalików dystalnych. Lauridsen i wsp. wykazali istotną korelację między zmianami w wydalaniu sodu z moczem a zmianami w wydalaniu frakcji beta (u-ENaCβ) u zdrowych ludzi. Wydaje się, że u-ENaCβ może być wykorzystana jako biomarker transportu sodu przez ENaC. W obecnym badaniu zmierzyliśmy frakcję gamma białka nabłonkowych kanałów sodowych w celu oceny regulacji w górę i w dół ekspresji γ-ENaC i transportu sodu przez ENaC, jak wcześniej donosiła nasza grupa .
Symporter sodowo-chlorkowy (NCC) w kanalikach dystalnych (DCT) jest kolejnym głównym szlakiem reabsorpcji sodu. Reabsorpcja sodu w DCT jest niezbędna do określenia ilości sodu dostarczanego do komórek głównych w kanaliku zbiorczym. Powszechnie uważa się, że NCC jest regulowana przez Ang II i aldosteron. Badania wykazały również, że wysokie AVP zwiększają fosforylację NCC i przypuszczalnie powodują większą reabsorpcję sodu .
Doświadczalne badania na zwierzętach wykazały, że izotoniczna i hipertoniczna sól IV zmniejszyła reabsorpcję sodu w kanalikach proksymalnych, a tym samym zwiększyła ilość sodu w moczu . Andersen LJ i wsp. badali wpływ hipertonicznego i izotonicznego roztworu soli u zdrowych osób na kontrolowanej diecie. Badani otrzymali dożylny ładunek sodu w postaci 25 ml/kg izotonicznego roztworu soli lub 4,5 ml/kg 3% hipertonicznego roztworu soli przez 90 minut. Wydalanie sodu z moczem wzrastało zarówno po podaniu izotonicznego, jak i hipertonicznego roztworu soli, przy czym natriureza po podaniu hipertonicznego roztworu soli przewyższała natriurezę po podaniu izotonicznego roztworu soli. Sód w osoczu i osmolarność osocza znacznie wzrosły po podaniu hipertonicznej soli, podobnie jak p-AVP. Nasze badania wykazały, że infuzja 3% NaCl zwiększyła u-ENaCγ, FENa, p-Osm, p-Na i p-AVP. Tak więc nasze wyniki odzwierciedlają zwiększoną reabsorpcję sodu przez ENaC w komórkach głównych, a ponadto potwierdzają wyniki Andersena i wsp. Wzrost u-ENaCγ można częściowo wyjaśnić znacznym zmniejszeniem nerkowej absorpcji sodu proksymalnie w nefronie, skompensowanym i dostosowanym przez wzrost absorpcji w części dystalnej. Jednakże wzrost p-AVP obserwowany bezpośrednio po infuzji 3% NaCl może również wskazywać, że wzrost u-ENaCγ jest spowodowany działaniem AVP. Zwiększony ruch sodu ze światła do komórki przez ENaC teoretycznie napędzałby wydzielanie potasu przez kanały ROMK. Zaskakująco zmierzyliśmy spadek wydalania potasu z moczem. To mogłoby przemawiać przeciwko głównej roli transportu sodu pośredniczonego przez ENaC. Gdyby NCC zwiększała reabsorpcję sodu, zarówno w celu skompensowania spadku reabsorpcji proksymalnej, jak i z powodu wysokiego p-AVP, wówczas mniej sodu byłoby transportowane przez ENaC i tym samym wydzielanie potasu nie miałoby miejsca. Możliwa rola NCC po infuzji hipertonicznego roztworu soli jest czysto spekulatywna, ponieważ nie mierzyliśmy aktywności NCC. Być może nie zaobserwowaliśmy pozytywnego wpływu na wydzielanie potasu w określonym przez nas czasie. Jednak transport potasu jest złożony, a czynniki modulujące transport potasu, takie jak zmieniony przepływ kanalikowy i aldosteron, są liczne.
Po rozszerzeniu objętości izotoniczną solą fizjologiczną ciśnienie onkotyczne jest nieznacznie zmniejszone, co prowadzi do natychmiastowego wzrostu GFR i mniejszej reabsorpcji wody w kanaliku proksymalnym. Zmierzyliśmy niewielki wzrost GFR i wyrzutu UO. Wydalanie sodu wzrosło, ale u-ENaCγ, p-Na, p-osm i p-AVP pozostały niezmienione, a więc wyniki były zgodne z naszymi oczekiwaniami. Jeśli chodzi o NCC, nie należy się spodziewać żadnych zmian w pośredniczonej przez NCC reabsorpcji sodu podczas podawania izotonicznej soli fizjologicznej.
Żadne badanie nie oceniało u-ENaCγ podczas diurezy wodnej. W naszym badaniu, zmierzyliśmy trend w kierunku zmniejszenia u-ENaCγ po infuzji glukozy, odzwierciedlając niewielką redukcję reabsorpcji sodu przez ENaC w komórce głównej. Jak wspomniano wcześniej, zmierzyliśmy 2% spadek p-osmolalności po infuzji glukozy, co teoretycznie powinno wywołać spadek AVP. Nie wykryliśmy spadku p-AVP, przypuszczalnie z powodu niskiego p-AVP spowodowanego wcześniejszym doustnym obciążeniem wodą lub faktem, że pomiary stężenia p-AVP mogą nie być wystarczająco czułe, aby wykryć małe zmiany. Można postawić hipotezę, że spadek u-ENaCγ może wynikać z braku wiązania AVP z receptorami V2 w błonie podstawno-bocznej komórki głównej. Brak bodźców AVP prowadzi do zwiększonej endocytozy kanałów ENaC z powierzchni błony do pęcherzyków recyklingowych, tam zmniejszając reabsorpcję sodu .
Tak więc, w ostatnim okresie po infuzji u-ENaCγ wzrósł wyraźnie po infuzji hipertonicznej soli, był w przybliżeniu na tym samym poziomie po izotonicznej soli i zmniejszył się lub miał tendencję do zmniejszenia w odpowiedzi na infuzję glukozy. Wzrost p-osm i p-AVP obserwowano bezpośrednio po zaprzestaniu infuzji 3% NaCl. Opóźnienie i stały poziom u-ENaCγ po hipertonicznej soli fizjologicznej można wyjaśnić faktem, że potrzeba kilku minut, aby zwiększyć trafficking wewnątrzkomórkowych magazynów kanałów ENaC do błony apikalnej, ale kilka minut, aby wydalić ENaC do moczu po stymulacji AVP.
Hormony wazoaktywne
Oprócz AVP, układ renina-angiotensyna-aldosteron (RAAS) jest kluczowym regulatorem nerkowego wydalania sodu, a tym samym objętości płynów ustrojowych. Dobrze wiadomo, że deplecja sodu aktywuje i że przewlekłe obciążenie sodem zmniejsza RAAS . Badania in vitro i in vivo wykazały, że aldosteron stymuluje receptor mineralokortykoidowy do zwiększonej transkrypcji genów kodujących białka zaangażowane w transport sodu, tj. ENaC i Na,K-ATPazę .
Liczne badania zmian objętości krwi wykazały, że ostre zmiany są związane z odwrotną regulacją układu renina-angiotensyna-aldosteron. W obecnym badaniu, rozszerzenie objętości z 3% i 0,9% soli fizjologicznej spowodowało podobne i znaczące zmniejszenie PRC, p-AngII i Aldo zgodne ze wzrostem objętości pozakomórkowej. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami .
Po infuzji glukozy nie stwierdziliśmy istotnych zmian w PRC, p-AngII i p-Aldo. Było to oczekiwane, ponieważ infuzja glukozy nie powoduje żadnych znaczących zmian w objętości pozakomórkowej. Nasze badanie nie zostało zaprojektowane tak, aby umożliwić jakiekolwiek efekty regulacyjne aldosteronu, ponieważ działanie aldosteronu występuje w ciągu godzin lub dni. Dlatego też inne czynniki muszą być zaangażowane w regulację ENaC.
Mocne strony i ograniczenia
Główną siłą tego badania był projekt jako randomizowane badanie krzyżowe z jednorodną grupą zdrowych młodych mężczyzn i kobiet. Warunki badania były bardzo dobrze zdefiniowane w odniesieniu do diety, spożycia sodu i płynów. W związku z tym wyniki nie zostały zakłócone przez różny bilans soli lub wody. Badanie to dotyczyło jedynie ostrych efektów rozszerzenia objętości. Bez wątpienia moglibyśmy uzyskać więcej informacji na temat długoterminowych skutków rozszerzenia objętości i wydalania AQP2 i ENaCγ z moczem, gdyby okres po infuzji był dłuższy. Dodatkowo, badanie nie było kontrolowane placebo, poprzez infuzję znikomej ilości 0,9% soli fizjologicznej. Mogłoby to pozwolić na odróżnienie efektów rozszerzenia objętości od ogólnej zmienności reabsorpcji wody i soli. W tym badaniu nie było możliwe wykonanie pomiarów ANP. Mogłoby to pozytywnie wpłynąć na nasze wyniki.