W celu zademonstrowania wykorzystania Escher-FBA w rzeczywistych zastosowaniach, przedstawiamy cztery kluczowe przykłady FBA, które mogą być wykonane bezpośrednio w przeglądarce. Są one zaadaptowane z przeglądu FBA i jego zastosowań. Przykłady te opierają się na domyślnym modelu podstawowym E. coli, więc są gotowe do wdrożenia natychmiast po otwarciu strony Escher-FBA. Upewnij się, że kliknąłeś przycisk Resetuj mapę pomiędzy każdym przykładem. Jeśli masz problemy ze znalezieniem reakcji, po prostu kliknij opcję Znajdź w menu Widok (lub klawisz „f” na klawiaturze), aby otworzyć pasek wyszukiwania.
FBA z alternatywnymi substratami węglowymi
Pierwszy przykład demonstruje użycie FBA do przewidywania, czy wzrost może zachodzić na alternatywnych substratach węglowych. Domyślny model podstawowy E. coli zawiera symulowane podłoże minimalne z D-glukozą jako źródłem węgla. Tutaj zmienimy źródło węgla z D-glukozy na bursztynian. Najpierw najedź myszką na reakcję wymiany bursztynianu EX_succ_e i zmień dolną granicę na – 10 mmol/gDW/godz. przeciągając suwak lub wpisując – 10 w polu Dolna granica. Następnie najedź myszką na reakcję wymiany D-glukozy EX_glc_e i albo podnieś dolną granicę do 0, albo kliknij przycisk Knockout. Domyślnym celem jest nadal maksymalizacja wzrostu, więc te dwie zmiany poinstruują program, aby obliczył maksymalne tempo wzrostu przy użyciu bursztynianu jako źródła węgla zamiast D-glukozy. Powinieneś zobaczyć, że maksymalne przewidywane tempo wzrostu zmniejsza się z 0,874 h- 1 do 0,398 h- 1, odzwierciedlając niższą wydajność wzrostu E. coli na bursztynianie (Rys. 2a). Jest to ogólne podejście do wprowadzania zmian w Escher-FBA; najedź myszką na reakcję, dokonaj wymaganych zmian, a Escher-FBA automatycznie wyświetli Twoje wyniki. Dolne wartości graniczne dla wymiany źródła węgla reprezentują pomiary eksperymentalne, więc można spróbować dostosować określoną dolną wartość graniczną do realistycznych wartości dla wzrostu na innych źródłach węgla.
Przykłady symulacji Escher-FBA. (a) Symulowany wzrost z bursztynianem jako jedynym źródłem węgla. (b) Symulacja wzrostu beztlenowego na podłożu o minimalnej zawartości glukozy. (c) Maksymalizacja wydajności ATP w modelu domyślnym. (d) Wzrost S. cerevisiae w modelu iMM904. Zauważ, że szerokość strzałek została zwiększona w menu ustawień, aby zmiany były bardziej widoczne
FBA podczas wzrostu beztlenowego
Wzrost beztlenowy może być symulowany w ten sam sposób poprzez najechanie myszką na reakcję EX_o2_e i kliknięcie Knockout lub zmianę dolnej granicy na 0. Jeśli zmienisz wymianę tlenu na zero, podczas gdy bursztynian jest nadal jedynym źródłem węgla, wskaźnik Flux Through Objective wyświetli „Niewykonalne rozwiązanie / Martwa komórka”, co oznacza, że wzrost nie jest możliwy. Spróbuj kliknąć przycisk Reset w prawym dolnym rogu, aby zasymulować minimalne podłoże z D-glukozą jako źródłem węgla, następnie wybij EX_o2_e, a przewidywana szybkość wzrostu powinna wynosić 0,211 h- 1 (Rys. 2b).
FBA z celami złożonymi
Escher-FBA obsługuje ustawianie wielu celów w trybie celów złożonych. W domyślnym modelu, ustawienie nowego celu zawsze wyłącza poprzedni cel. Aby włączyć ten tryb, należy najpierw kliknąć przycisk Złożone cele na dole ekranu. Przykład użycia tego trybu: aby sprawdzić maksymalne tempo wzrostu przy jednoczesnym minimalizowaniu strumienia przez SUCDi, należy zacząć od domyślnego celu maksymalizacji produkcji biomasy. Następnie, najedź myszką na etykietę reakcji dla SUCDi i kliknij przycisk Minimalizuj w podpowiedzi narzędzia. W prawym dolnym rogu powinna pojawić się lista obu celów. Zauważ, że obecnie obsługiwane są tylko współczynniki celu równe 1 lub – 1 (reprezentowane przez Maksymalizuj i Minimalizuj). Aby powrócić do pojedynczych celów, wystarczy ponownie kliknąć przycisk Cele związków.
Analiza wydajności metabolizmu
Możemy również użyć Escher-FBA do określenia maksymalnych wydajności prekursorów i kofaktorów, takich jak ATP. Wszystko, co jest wymagane, to stechiometrycznie zrównoważona reakcja, która zużywa interesujący nas kofaktor. Reakcja utrzymania ATP (ATPM) jest jednym z takich przykładów. Aby określić maksymalną produkcję ATP, wystarczy najechać myszką na reakcję ATPM i kliknąć przycisk Maksymalizuj. Ustawienie celu w ten sposób działa, ponieważ aby system zmaksymalizował strumień przez reakcję ATPM, musi najpierw wyprodukować ATP w najwyższej możliwej ilości. Kiedy ATPM jest maksymalizowane w domyślnym modelu metabolizmu podstawowego E. coli, wartość celu wynosi 175 mmol/gDW/godz. (Rys. 2c). Przy zastosowaniu bursztynianu jako źródła węgla, wartość ta spada do 82,5 mmol/gDW/godz. Ta sama procedura może być zastosowana dla każdego interesującego nas metabolitu poprzez utworzenie zrównoważonej stechiometrycznie reakcji zużycia i ustawienie modelu tak, by maksymalizował strumień przez tę reakcję. Zauważ, że obecnie nie jest możliwe automatyczne utworzenie takiej reakcji w Escher-FBA, ale może to zostać dodane w przyszłym wydaniu.
Analiza zmienności przepływu
Analiza alternatywnych optymalnych rozwiązań w metabolizmie jest kolejnym użytecznym zastosowaniem FBA . Ponieważ rozwiązania uzyskane za pomocą FBA są często niepowtarzalne, przydatna może być znajomość zakresu wartości strumienia, jaki może mieć dana reakcja. Analiza zmienności strumienia (FVA) jest często używana do obliczania tych zakresów w całej sieci. Escher-FBA nie obsługuje bezpośrednio obliczeń FVA, ale możliwe jest ich obliczenie dla danej reakcji. Aby to zrobić, należy najpierw najechać myszką na funkcję celu (reakcja biomasy Biomass_Ecoli_core_w_GAM) i ustawić górną i dolną granicę na wartość nieco mniejszą niż aktualna wartość strumienia (w domyślnej mapie spróbuj 0.870). Następnie należy najechać myszką na interesującą nas reakcję i kliknąć przyciski Maksymalizuj i Minimalizuj, aby zobaczyć maksymalny i minimalny strumień przechodzący przez tę reakcję przy optymalnym tempie wzrostu. Na przykład, maksymalizacja i minimalizacja strumienia przez GAPD w glikolizie daje realny zakres strumienia 15.44-16.68 mmol/gDW/hr, wskazując, że strumień glikolityczny jest wysoce ograniczony przy wysokim tempie wzrostu. Z drugiej strony, maksymalizacja i minimalizacja strumienia przez MALS w boczniku glioksylanowym daje realny zakres strumienia 0-2,64 mmol/gDW/godzinę, wskazując, że bocznik glioksylanowy może być aktywny lub nieaktywny przy wysokim tempie wzrostu. Ta procedura może być wykonana z dowolnym zestawem reakcji i użytkownik może ograniczyć swój system do dowolnej liczby wartości strumienia, aby zobaczyć zakres rozwiązań dostępnych dla konkretnej reakcji.
Używanie innych modeli w skali genomu
Domyślny model rdzenia E. coli nie jest jedynym systemem, który może być symulowany. Na przykład, jeśli ktoś chce przeprowadzić symulacje na komórce drożdży, model i mapę dla Saccharomyces cerevisiae można pobrać z http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. Na tej stronie kliknij przycisk pobierania dla modelu (iMM904.json) i mapy (iMM904.Central carbon metabolism.json). Załaduj je w Escher-FBA, klikając Load Map JSON w menu Map i Load Model JSON w menu Model, aby załadować oba pliki JSON. Po załadowaniu, mapa jest gotowa do edycji i symulacji za pomocą dowolnych narzędzi w Escher lub Escher-FBA (Rys. 2d). W przypadku większego modelu, takiego jak iMM904, nie wszystkie reakcje będą widoczne na raz, ale można dodać reakcję do wizualizacji. W tym celu należy najpierw kliknąć ikonę klucza na pasku bocznym lub wybrać Add reaction mode z menu Edit. Teraz reakcje można dodawać, klikając w dowolnym miejscu na mapie i wybierając pożądaną reakcję z rozwijanego menu. Pole wprowadzania tekstu może być używane do wyszukiwania interesującej nas reakcji.
Zastosowanie Escher-FBA do projektowania fabryki komórek mikrobiologicznych
Aby dostarczyć przykład hipotezy badawczej, która może być testowana przy użyciu Escher-FBA, załadowaliśmy modele E. coli w skali genomu, zawierające dwie drogi wytwarzania 1-propanolu do produkcji chemicznej. Ścieżki te zostały ostatnio przeanalizowane w badaniu dotyczącym mocy predykcyjnej modeli w skali genomu do symulacji rzeczywistych szczepów fabryki komórek mikrobiologicznych. Pierwszy model obejmuje pojedynczą drogę do produkcji 1-propanolu (plik dodatkowy 1) po raz pierwszy opisaną przez Atsumi i wsp. Drugi model zawiera dwie synergistyczne ścieżki do produkcji 1-propanolu (plik dodatkowy 2) po raz pierwszy zgłoszone przez Shen i Liao . Każdy model może być załadowany oddzielnie (za pomocą przycisku menu Model > Załaduj model COBRA JSON), a pojedyncza mapa centralnego metabolizmu jest dostarczona, która jest kompatybilna z obydwoma modelami (plik dodatkowy 3, może być załadowana za pomocą przycisku menu Mapa > Załaduj mapę JSON).
Byliśmy ciekawi, czy synergistyczne podejście do produkcji 1-propanolu – o którym wiadomo, że ma wyższą wydajność produkcji – ma również różnicę w wymaganym wykorzystaniu ścieżek. Dlatego wczytaliśmy każdy model indywidualnie, zmaksymalizowaliśmy wydalanie 1-propanolu (najechaliśmy na EX_1poh_e i kliknęliśmy Maksymalizuj), ustawiliśmy dolną granicę wydalania na 99% maksimum, a następnie zminimalizowaliśmy strumień przez pierwszy zaangażowany krok ścieżki pentozowo-fosforanowej, dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową (G6PDH2r). Otrzymane mapy pokazują, że synergistyczne ścieżki do produkcji 1-propanolu są stechiometrycznie zrównoważone z glikolizą, a więc nie wymagają aktywności PPP (Rys. 3b). Z drugiej strony, szlak indywidualny wymaga znaczącego strumienia PPP (Rys. 3a). Inne wykorzystanie ścieżek, takie jak niezbędny strumień TCA dla każdego przypadku, można również zbadać na tych mapach.
Zastosowanie ścieżek dla dwóch heterologicznych ścieżek do produkcji 1-propanolu w E. coli. Strumień szlaku pentozo-fosforanowego (PPP) niezbędny dla każdej heterologicznej ścieżki produkcji może być porównany przez, po pierwsze, wymuszenie produkcji 1-propanolu na poziomie 99% wartości maksymalnej (przez ustawienie dolnej granicy reakcji wymiany 1-propanolu) i, po drugie, zminimalizowanie strumienia przez pierwszy krok w PPP. (a) Ścieżka produkcji 1-propanolu opisana przez Atsumi et al. wykorzystuje pojedynczą ścieżkę do osiągnięcia produkcji 1-propanolu. Wymaga ona znacznego strumienia PPP i ma niższą ogólną wydajność. (b) Ścieżka opisana przez Shen i Liao wykorzystuje dwie ścieżki synergistycznie w celu osiągnięcia wyższej wydajności. Ścieżka jest stechiometrycznie zbilansowana z glikolizą, więc nie wymaga strumienia PPP
Pomimo, że Escher-FBA może być już użyty do wielu symulacji FBA bezpośrednio w przeglądarce internetowej, szereg przykładów przedstawionych przez Orth i in. nie może być obecnie zrealizowanych za pomocą Escher-FBA . Na chwilę obecną Escher-FBA nie może wykonywać takich funkcji jak analiza nokautu genów czy analiza odporności. Jednak Escher-FBA wykorzystuje elastyczne reprezentacje SVG dla elementów wizualnych, więc analiza odporności, a nawet funkcje graficzne, takie jak płaszczyzny fazowe, mogą zostać dodane. Stworzyliśmy mapę drogową rozwoju Escher-FBA (dostępną na stronie domowej https://sbrg.github.io/escher-fba) i iteracyjny proces rozwoju, aby ostatecznie umożliwić złożoną analizę biologii systemów w przeglądarce internetowej.