Study population
This investigation is based on the HAPIEE cohorts (Health, Alcohol and Psychosocial factors in Eastern Europe) from Poland, Czech Republic, and Lithuania , and the 8-year follow-up of the German ESTHER cohort (German name: „Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung”) .
Całkowite badanie HAPIEE obejmuje kohorty w czterech krajach. Ponieważ nie było możliwe wyeksportowanie próbek krwi z Rosji, tylko trzy kohorty zostały uwzględnione w obecnej analizie. Uczestnicy badania zostali zrekrutowani w sześciu czeskich miastach (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec, and Usti nad Labem) w latach 2002-2005 (n = 8 857), w Krakowie, w Polsce, w latach 2002-2005 (n = 10 728) i w Kownie, na Litwie, w latach 2006-2008 (n = 7 161). Każda kohorta składa się z losowej próby mężczyzn i kobiet w wieku 45-75 lat w momencie rozpoczęcia badania, stratyfikowanych według płci i 5-letnich grup wiekowych, wybranych z rejestrów ludności. Ogólny odsetek odpowiedzi wyniósł 61%. Dane zostały zebrane za pomocą kwestionariusza i krótkiego badania w klinice, podczas którego pobrano próbkę krwi żylnej na czczo.
Badanie ESTHER jest populacyjną kohortą 9 949 dorosłych, w wieku 50-74 lat w momencie początkowym, rekrutowanych przez ich lekarzy ogólnych (GP) podczas rutynowej kontroli zdrowia w latach 2000-2002 w niemieckim kraju związkowym Saara. Obecne badanie opiera się na 8-letniej obserwacji, przeprowadzonej między lipcem 2008 a grudniem 2010 roku, kiedy to uczestnicy badania byli w wieku od 56 do 85 lat. Od momentu rozpoczęcia badania do 8-letniej obserwacji 499 osób zmarło, 505 osób nie było już w stanie uczestniczyć w badaniu ze względu na zły stan zdrowia, a 680 osób odmówiło dalszego uczestnictwa. Z pozostałych 8 265 uczestników 6 061 odesłało kwestionariusz (wskaźnik odpowiedzi 73,4%), a 4 637 oddało próbkę krwi w gabinecie swojego lekarza rodzinnego. Lekarze rodzinni uczestników badania również wypełnili kwestionariusz dotyczący stanu zdrowia uczestników badania (dostępny dla n = 5 997). Ponadto 3 124 uczestników badania wyraziło zgodę na dodatkową 3-godzinną ocenę geriatryczną przeprowadzoną przez lekarzy prowadzących badanie w domach uczestników.
Zmienne w badaniach ESTHER i HAPIEE zostały zharmonizowane, a markery stresu oksydacyjnego zmierzono w ramach Consortium on Health and Ageing: Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES; www.chancesfp7.eu), który został opisany w innym miejscu . Badania są prowadzone zgodnie z deklaracją helsińską, a pisemna świadoma zgoda została uzyskana od wszystkich uczestników badania.
Etyka, zgoda i pozwolenia
Zawarte badania zostały zatwierdzone przez odpowiednie lokalne komisje etyczne (ESTHER: Wydział Medyczny Uniwersytetu w Heidelbergu i Stowarzyszenie Medyczne Saary; HAPIEE: University College London (Wielka Brytania), National Institute of Public Health (Praga, Republika Czeska), Uniwersytet Jagielloński (Kraków, Polska) i Litewski Uniwersytet Nauk o Zdrowiu (Kowno, Litwa)). Od wszystkich uczestników włączonych do analizowanych badań uzyskano pisemną świadomą zgodę, a badania są prowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.
Ocena zmiennych
W badaniach ESTHER i HAPIEE dane socjodemograficzne, dotyczące stylu życia i historii chorób oceniano za pomocą samodzielnie wypełnianych kwestionariuszy. W badaniu ESTHER dokonano pomiaru wysokości i masy ciała, a w przypadku uczestników badania, którzy nie wyrazili zgody na wizytę domową, uzupełniono je informacjami podawanymi przez samych siebie. Oprócz informacji podawanych przez samego siebie, w badaniu ESTHER historia powszechnych chorób przewlekłych została zweryfikowana przez sprawdzenie dokumentacji medycznej lub rejestru nowotworów Kraju Saary. Upośledzenie czynności nerek definiowano na podstawie szacunkowego współczynnika filtracji kłębuszkowej <60 mL/min/1,73 m2, obliczanego za pomocą równania Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration opartego na kreatyninie. W kohorcie ESTHER stężenie kreatyniny w surowicy oceniano kinetyczną metodą Jaffégo na aparacie Cobas 8000 C701 (analit: CREJ2 3000, Roche). Cholesterol całkowity i cholesterol lipoprotein o dużej gęstości (HDL) oceniano w próbkach surowicy metodą chromatografii enzymatycznej (anality: Chol2 2100, HDLC3 450, Roche), a białko C-reaktywne (CRP) metodą immunoturbidymetrii w aparacie Cobas 8000 C701 (analit: CRPL3 500, Roche). W HAPIEE cholesterol całkowity i HDL oceniano również przy użyciu tej samej metodyki oznaczeń i analitów firmy Roche, ale stosowano różne autoanalizatory (HAPIEE Czechy i Litwa: Roche Cobas Mira; HAPIEE Polska: Hitachi 917/Modular P). Ponadto we wszystkich kohortach HAPIEE kreatynina i CRP w surowicy były oceniane przy użyciu tej samej metodologii oznaczeń, co w badaniu ESTHER, ale przy użyciu analitów pochodzących od innego dostawcy (Beckman-Coulter) i na innym autoanalizatorze (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).
Stwierdzenie śmiertelności
Do tych analiz wykorzystaliśmy śledzenie całkowitej śmiertelności przez oficjalne ogólnokrajowe (Republika Czeska, Niemcy), lokalne (Litwa) lub regionalne rejestry śmiertelności (Polska) do 31 grudnia 2010 r. w Polsce, 31 grudnia 2011 r. w Republice Czeskiej i na Litwie oraz do 31 lipca 2014 r. w Niemczech. Śmiertelność specyficzna dla przyczyny w Niemczech była dostępna tylko dla zgonów, które wystąpiły do 2 kwietnia 2013 r. Rejestry były kompletne dla wszystkich uczestników, którzy nie przenieśli się poza region objęty rejestrem. Utrata obserwacji z powodu migracji wyniosła 4% w kohortach HAPIEE (łącznie) i 2% w badaniu ESTHER. Wszystkie zgony zakodowane kodami ICD-10 I00-I99 uznano za zgony z przyczyn sercowo-naczyniowych, a zgony z powodu nowotworów określono kodami ICD-10 C00-C97.
Pomiar markerów stresu oksydacyjnego w surowicy
Atesty używane do pomiaru poziomów d-ROMs (Diacron, Grosseto, Włochy) i TTL (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Turcja) zostały dostosowane do autoanalizatora (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Holandia) w Laboratorium Badań nad Ochroną Zdrowia (Bilthoven, Holandia), jak opisano wcześniej . Test d-ROMs mierzy stężenie nadtlenku wodoru w jednostkach Carratelli (Carr U), nazwanych tak na cześć wynalazcy testu, Mauro Carratelli. Każda jednostka Carr U odpowiada 0,08 mg nadtlenku wodoru (H2O2)/100 mL w próbce. Test TTL mierzy stężenie wolnych grup tiolowych w próbce w μmol/L.
Pomiary zostały przeprowadzone w próbkach surowicy, które były przechowywane przez około 3-10 lat w zamrażarkach o temperaturze -80 °C. d-ROMs i TTL mają dobrą długoterminową stabilność w tych warunkach. W 8-letniej kontynuacji badania ESTHER, d-ROMs i TTL były mierzone u wszystkich uczestników, którzy oddali próbki krwi w gabinetach lekarzy pierwszego kontaktu (n = 4,637). Pomiary przeprowadzono jednak w dwóch różnych punktach czasowych, ponieważ fundusze nie były dostępne, aby zmierzyć wszystkie próbki w badaniu pilotażowym przeprowadzonym w czerwcu 2012 roku . Aby skorygować potencjalne przesunięcia w oznaczeniach, 80 próbek z punktu czasowego 1 (czerwiec 2012 r.) zmierzono ponownie w punkcie czasowym 2 (wrzesień 2014 r.) i uzyskano równania regresji liniowej, które wykorzystano do standaryzacji wyników z punktu czasowego 2 do poziomów z punktu czasowego 1, kiedy również miały miejsce pomiary w kohortach HAPIEE (przez cały rok 2012). Zgodność pomiarów d-ROMs była wysoka (współczynnik korelacji Spearmana r = 0,92 i różnica średnich = 15 Carr U) i dlatego nie stosowano korekt. Dla TTL, oczywiste przesunięcie w wynikach oznaczenia (r = 0,88 i różnica średnich = 81 μmol/L) zostało skorygowane przez zastosowanie następującego równania do wszystkich pomiarów w punkcie czasowym 2: TTLtime-point2 = 0,746 × TTLtime-point1. Ponadto wykluczyliśmy 610 pomiarów w próbkach krwi, które nie spełniały ścisłych kryteriów jakości hemolitycznej, ikterycznej i lipemicznej w badaniu ESTHER, pozostawiając 4 027 do analizy w obecnym badaniu. W kohortach HAPIEE liczba próbek, które nie spełniały tych kryteriów jakości, była nieistotna.
Próba badania analitycznego
Z powodu ograniczonych funduszy, poziomy d-ROMs i TTL nie były mierzone u wszystkich uczestników kohort HAPIEE; zamiast tego przyjęto dopasowany projekt kontroli przypadków (Dodatkowy plik 1: Rysunek S1). Przypadki zdefiniowano jako wszystkich uczestników, którzy zmarli podczas obserwacji (n = 1 433) lub doświadczyli incydentalnego zawału mięśnia sercowego (MI) lub udaru mózgu bez zgonu (n = 658). Kontrole (n = 4,396) były dopasowane pod względem częstości do przypadków według płci i 5-letnich grup wiekowych. W celu skorygowania nadmiernego doboru próby dla MI i udaru w tej analizie śmiertelności, osoby z nie-śmiertelnym MI lub nie-śmiertelnym udarem podczas obserwacji zostały wyłączone z przypadków w pierwszym kroku. W celu dodania reprezentatywnej próby osób z niepomyślnym incydentem MI lub udaru do kontroli, w drugim kroku obliczono obserwowany odsetek niepomyślnych incydentów MI lub udaru w każdej warstwie wiekowej i płciowej w całej kohorcie. W trzecim kroku proporcje te zostały pomnożone przez wielkości próbek w każdej warstwie w kontrolach z mierzonymi markerami stresu oksydacyjnego. W czwartym kroku uzyskane liczby zostały losowo wybrane w każdej warstwie z grupy osób z niezakończonym zgonem incydentem MI lub udarem i dodane do kontroli, co dało pulę 4 552 kwalifikujących się kontroli dla 1 433 zgonów. W ostatnim etapie, pula kwalifikujących się kontroli została wykorzystana do indywidualnego dopasowania dokładnie dwóch kontroli do każdego zgonu według kohorty, płci i wieku (±5 lat).
Analizy statystyczne
Różnice w charakterystyce linii podstawowej między przypadkami (śmierć podczas obserwacji) i kontrolami oceniano za pomocą testu χ2 dla zmiennych kategorycznych i testu sumy rang Wilcoxona dla zmiennych ciągłych. Przekrojowe skojarzenia ustalonych czynników ryzyka śmiertelności z wysokim poziomem stresu oksydacyjnego oceniano za pomocą modeli regresji logistycznej obejmujących wszystkie cechy linii podstawowej modelowane jako zmienne kategoryczne (Tabela 1). Zmienna zależna „wysoki poziom stresu oksydacyjnego” została zdefiniowana za pomocą dwóch różnych definicji opartych na poziomach d-ROMs lub TTL. W przypadku d-ROMs, zgodnie z instrukcjami producenta, zastosowano kliniczne odcięcie >400 Carr U, które sklasyfikowało 23% kohorty ESTHER i 30% kwalifikujących się kontroli z kohorty HAPIEE w kategorii „wysokiego” stresu oksydacyjnego. Dla TTL nie są dostępne kliniczne punkty odcięcia, a ponieważ badanie nie jest jeszcze znormalizowane, średnie wartości dla populacji różniły się znacznie między kohortami. Dlatego też, aby dopasować odsetek osób z wysokim stresem oksydacyjnym uzyskanym przez definicję opartą na poziomach d-ROMs, dolny kwartyl TTL specyficzny dla kohorty (25%) został użyty do zaklasyfikowania uczestników do kategorii wysokiego stresu oksydacyjnego na podstawie TTL. Analizy przekrojowe przeprowadzono u wszystkich badanych oraz oddzielnie u kobiet i mężczyzn.
Dla analiz podłużnych, Regresja proporcjonalnego zagrożenia Coxa (kohorta ESTHER) i warunkowa regresja logistyczna (dopasowane badanie kontrolne przypadków HAPIEE) zostały wykorzystane do oszacowania współczynników zagrożenia i współczynników szans, odpowiednio, dla wzrostu poziomu d-ROMs i spadku TTL o jedno kohortowe odchylenie standardowe (SD). Ponadto poziomy d-ROMs modelowano również jako zmienną kategoryczną, z zalecanymi przez producenta klinicznymi punktami odcięcia dla umiarkowanego (341-400 Carr U), wysokiego (401-500 Carr U) i bardzo wysokiego stresu oksydacyjnego (>500 Carr U) w odniesieniu do osób z niezwiększonym lub niskim stresem oksydacyjnym (≤340 Carr U). Gdy ryzyko bezwzględne jest niskie, regresja logistyczna i regresja Coxa dają zwykle podobne wyniki, a iloraz szans może być traktowany jako przybliżenie dokładniejszego ilorazu zagrożeń. Dla obu oszacowań efektu używaliśmy terminu ryzyko względne (RR). W analizie wrażliwości przeprowadzono analizy dotyczące śmiertelności specyficznej dla przyczyny w kohorcie ESTHER, biorąc pod uwagę konkurencyjne ryzyko zgonu z powodu innych przyczyn, dopasowując model regresji proporcjonalnego ryzyka subdystrybucji z wagami dla uczestników, którzy przeszli zdarzenie konkurencyjnego ryzyka zgodnie z rozszerzeniem metody Fine i Gray . Jednak wyniki były prawie identyczne z tradycyjną proporcjonalną regresją zagrożeń Coxa i dlatego tylko te ostatnie wyniki są przedstawione w tym manuskrypcie.
Analizy przeprowadzono oddzielnie dla każdej kohorty i połączono za pomocą metaanalizy z ważeniem Mantela-Haenszela i efektami losowymi , biorąc pod uwagę wielkość próby kohort i możliwość statystycznej heterogeniczności wśród badań. Tę ostatnią zbadano za pomocą testu Q Cochrane’a i statystyki I2.
Przeanalizowano następujące wyniki: umieralność z wszystkich przyczyn, CVD, nowotworów i przyczyn innych niż CVD, nienowotworowych. Dla każdego wyniku opracowano cztery modele statystyczne, przy czym do modeli w coraz większym stopniu włączano ustalone czynniki ryzyka śmiertelności. Zarówno poziom d-ROMs, jak i TTL były zawsze uwzględniane w tym samym modelu, ponieważ ich korelacja była niska (r <0,08 w każdej kohorcie). W modelu 1 dokonano korekty ze względu na wiek i płeć w kohorcie ESTHER, natomiast nie było to konieczne w kohorcie HAPIEE, ponieważ przypadki były indywidualnie dopasowywane do dwóch kontroli pod względem wieku i płci i analizowane w analizie warstwowej, w której warstwy składają się ze zbioru dopasowanych zestawów. Model 2 dodatkowo korygował wykształcenie, wskaźnik masy ciała (BMI), palenie tytoniu, spożycie alkoholu i aktywność fizyczną. Model 3 uwzględniał również choroby, które potencjalnie mogą pośredniczyć w związku stresu oksydacyjnego ze śmiertelnością (tj. dyslipidemię (ocenianą za pomocą cholesterolu całkowitego i HDL), upośledzenie funkcji nerek, cukrzycę w wywiadzie, nadciśnienie tętnicze, zawał serca, udar mózgu i nowotwory). Ostatecznie model 4 został dodatkowo skorygowany o poziom CRP, który był silnie skorelowany z poziomem d-ROMs (r = 0,34-0,41 w kohortach) oraz, mniej silnie, z TTL (r = 0,11-0,17 w kohortach). Wiek był modelowany jako zmienna ciągła, a wszystkie inne zmienne były modelowane jako zmienne kategoryczne (kategorie są przedstawione w Tabeli 1). Testowaliśmy dla interakcji między d-ROMs/TTL z kowariantami, dodając odpowiednie warunki interakcji do modelu 2.
Podgrupy do analizy zostały wybrane a priori w celu stratyfikacji dla najważniejszych potencjalnych czynników determinujących wysoki poziom stresu oksydacyjnego: kohorty / kraju, wieku, płci, historii MI lub raka i stanu zapalnego. Ze względu na ograniczenia wielkości próby, analizy stratyfikacyjne ograniczono do umieralności ze wszystkich przyczyn, CVD i nowotworów. Aby wyeliminować możliwość wystąpienia błędu odwrotnej przyczynowości, analizy przeprowadzono oddzielnie dla zdarzeń, które wystąpiły w latach 1-2, latach 3-4 i latach 5-6 obserwacji. Ze względu na ograniczenia wielkości próby, ta analiza warstwowa mogła być przeprowadzona tylko dla śmiertelności z wszystkich przyczyn. Aby uniknąć niestabilności modelu, wynik analizy podgrupy specyficznej dla kohorty został uwzględniony w metaanalizie tylko wtedy, gdy w podgrupie wystąpiło co najmniej 25 zdarzeń.
Wielokrotna imputacja została zastosowana do imputacji liczby brakujących wartości zmiennych wyjściowych przedstawionych w pliku dodatkowym 1: Tabela S1. Odsetek brakujących wartości wynosił poniżej 5% dla wszystkich zmiennych, z wyjątkiem spożycia alkoholu i aktywności fizycznej, które miały do 22% brakujących wartości. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, dane były brakujące losowo, co jest założeniem wielokrotnej imputacji. Oddzielnie według kohorty, statusu przypadku i płci, 20 kompletnych zestawów danych zostało imputowanych za pomocą procedury SAS 9.3 „PROC MI”, przy użyciu metody łańcucha Markowa Monte Carlo. Zmienne z „pełnego” modelu zostały użyte do modelu imputacji. Wszystkie analizy wieloczynnikowe przeprowadzono w 20 imputowanych zbiorach danych, a wyniki poszczególnych zbiorów danych połączono za pomocą procedury SAS 9.3 „PROC MIANALYZE”.
Metaanalizy przeprowadzono za pomocą oprogramowania statystycznego Comprehensive Meta-Analysis 2.0 (Biostat, Englewood, NJ, USA). Wszystkie pozostałe analizy przeprowadzono za pomocą programu SAS, wersja 9.2 (Cary, North Carolina, USA). Wszystkie testy statystyczne były dwustronne, z zastosowaniem poziomu alfa 0,05.
.