Frontiers in Materials

Extracellular Matrix

Interakcje pomiędzy białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i komórkami odgrywają ważną rolę w organizacji cytoszkieletu, wzroście komórek, migracji komórek i rozwoju tkanek (Zhong i in., 1998; Sternlicht i Werb, 2001; Stevens i George, 2005). ECM zawiera wydzielone cząsteczki, które tworzą mikrośrodowisko komórkowe. Głównymi składnikami ECM jest sieć hydrofilowych, rozszerzonych żeli glikozaminoglikanów (GAG) i białek włóknistych, w tym elastyny, kolagenów, lamininy i fibronektyny, które łączą się ze sobą poprzez specyficzne domeny wiążące, zarówno wewnątrz-, jak i międzycząsteczkowe. GAGs, takie jak siarczan heparanu, siarczan chondroityny i siarczan keratanu, są silnie napęczniałymi polimerami węglowodanowymi, połączonymi z białkami ECM w celu utworzenia proteoglikanów. GAG mogą zatrzymywać wodę poprzez osmozę, aby utrzymać czynniki wzrostu, ECM i komórki uwodnione i aktywne. Cząsteczki GAG mogą regulować szeroki zakres czynności biologicznych, w tym angiogenezę, procesy rozwojowe, przerzuty nowotworowe i krzepnięcie krwi (Kim et al., 2011). Na przykład kolageny, najobficiej występujące białka w ECM, stanowią 90% zawartości białek macierzy kostnej. Kolageny są obecne w ECM jako białka fibrylarne i stanowią strukturalne rusztowanie dla komórek. Strukturalnie kolagen jest zbudowany z prokolagenu, który składa się z trzech lewoskrętnych helikali. Włóknisty prokolagen jest ułożony w wydłużoną strukturę superhelisy o średnicy około 1,5 nm i długości około 300 nm. Prokolageny mogą spontanicznie układać się in vivo i in vitro w fibryle o długości do kilku mikronów i szerokości od 10 do 500 nm, o periodyczności 67 nm. Stwierdzono, że stany agregacji i dystrybucja przestrzenna kolagenów modulują rozwój komórkowy i sygnalizację poprzez rozpoznawanie integryn (Hui i in., 2008; Huang i in., 2010a).

Fibronektyny są glikoproteinami, które przyłączają komórki do rusztowań kolagenowych w ECM, umożliwiając komórkom migrację przez ECM. Dlatego też, w organizacji podstawowej struktury sieci ECM i kontroli zachowań komórek, przyłączanie fibronektyn do kolagenów jest szczególnie istotne (roekelmann i in., 1991; Dalton i in., 1995). W gojących się ranach, na przykład, fibroblasty wykazują wysoki poziom ekspresji aktyny mięśni gładkich, prokolagenu i fibronektyny. Wykazano, że fibronektyna jest mediatorem przylegania komórek do kolagenu. Tak więc, przyleganie komórek do ECM jest ważne dla późniejszych zachowań związanych z różnicowaniem i proliferacją (Ingber, 2003). W środowisku in vitro, komórki są wysiewane na powierzchnie hodowlane i wkrótce mogą dostosować się do swojego środowiska poprzez wydzielanie odpowiednich białek ECM, takich jak fibronektyna, w celu przebudowy powierzchni dla lepszego rozprzestrzeniania się i przylegania. Interakcje międzycz±steczkowe w ECM zmieniaj± się dynamicznie wraz z aktywno¶ci± komórek. Ten złożony proces jest związany ze środowiskiem hodowli, w tym z podłożem hodowlanym, zaadsorbowanymi białkami, podłożem i typami komórek. Stwierdzono, że wystarczający poziom fibronektyny jest wymagany do adhezji i rozprzestrzeniania się komórek na powierzchniach pokrytych kolagenem (Grinnell i Minter, 1978; Dewez i in., 1999). Ponadto, właściwości powierzchniowe podłoża dominują nad adhezją białek, prowadząc do różnej zawartości powierzchniowej, konformacji i koncentracji osadzonych białek. Należy zauważyć, że tradycyjne systemy hodowlane, takie jak szkło i polistyren do hodowli tkankowych, ułatwiające niespecyficzną adsorpcję białek, nie są w stanie zdecydowanie zbadać oddziaływań pomiędzy komórkami a odpowiednim składnikiem/białkiem w ECM.

Większość komórek ssaków może rosnąć in vitro tylko wtedy, gdy są przyczepione do powierzchni z osadzonymi białkami ECM. ECM zapewnia więcej niż strukturalne i mechaniczne wsparcie, implikacje w niszach komórek macierzystych, wzorowanie rozwoju i postęp raka. Fizyczne wła¶ciwo¶ci ECM mog± również pełnić krytyczn± rolę w procesie sygnalizacji. Struktury ECM mogą być rozciągliwe i elastyczne, a różne napięcia mechaniczne mogą nakładać się na krypty, które mogą dalej reagować z ich receptorami lub czynnikami wzrostu. W odniesieniu do właściwości mechanicznych, ECM może posiadać różne stopnie elastyczności i sztywności, od twardych tkanek kostnych do miękkiego mózgu, zgodnie z ich składem, stężeniem i strukturami sieciującymi. Elastyczność ECM może rozciągać się na kilka rzędów wielkości, co, jak wykazano, odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu wielu funkcji komórek, takich jak skurcz komórkowy, proliferacja komórek, migracja, różnicowanie i śmierć komórek (Discher i in., 2005; Engler i in., 2006). Ponadto odkryto, że nanostruktury białek ECM mogą znacząco wpływać na aktywność komórki (Koyama i in., 1996; Jones i in., 1997; Huang i in., 2010a). Kolagen typu I w naturze spontanicznie tworzy strukturę helisy. Po poddaniu działaniu ciepła i kwasu regularna trójwymiarowa struktura kolagenu zostaje zniszczona (zdenaturowany kolagen lub żelatyna). Zaskakująco, zdenaturowany kolagen sprzyja lepszemu rozprzestrzenianiu się i proliferacji komórek mięśni gładkich (SMC) w porównaniu z kolagenem typu dzikiego (kolagen natywny). Badania mechanistyczne wykazały, że kolagen natywny hamuje fosforylację kinazy 2 zależnej od cykliny (Cdk2) i kinazy związanej z cykliną E, jednocześnie zwiększając poziom inhibitorów Cdk2 p21Cip1/waf1 i p27Kip1 (Koyama i in., 1996). Efekt ten okazał się kontrolować wzrost płucnych komórek macierzystych w systemie hodowli pierwotnej (Huang i in., 2010a). System ten zawierał komórki zrębu, płucne komórki macierzyste i kolagen typu I. Kiedy rozmiar fibryli kolagenu wzrasta, proliferacja i rozprzestrzenianie się mezenchymalnych komórek zrębu zmniejsza się, co prowadzi do zahamowania wzrostu pierwotnych neonatalnych komórek płucnych (Huang i in., 2010a). Dlatego mezenchymalne komórki zrębowe służą jako komórki niszowe do bezpośredniej regulacji zdolności odnowy nabłonkowych komórek macierzystych płuc.

Dynamiczne funkcjonalne biointerfejsy

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy rozpoznawania i regulacji między ECM a komórkami, stworzono kilka systemów modelowych opartych na funkcjonalnych monowarstwach samoprzylepnych (SAMs) (Roberts i in., 1998; Xiao i in., 1998; Rezania i in., 1999). SAMs alkanetiolanów na powierzchniach złota mogą zawierać mieszaniny cząsteczek argininy-glicyny-asparaginianu (RGD) i oligo(glikolu etylenowego) (OEG). RGD jest trójpeptydem, który promuje adhezję komórek poprzez wiązanie się z receptorami integryn na powierzchni komórek, a OEG jest zwykle używany do przeciwstawiania się niespecyficznej adsorpcji białek i komórek. Frakcja i struktura trójpeptydowych cząsteczek RGD pozwoliła na manipulowanie zachowaniami adhezyjnymi komórek. Układy te pozwoliły do pewnego stopnia wyjaśnić złożone działania biologiczne. Jednakże, jak wspomniano powyżej, właściwości mechaniczne i oddziaływania molekularne pomiędzy składnikami ECM (tj. fibronektyna-kolagen i GAG-kolagen) w mikrośrodowisku mogą w znacznym stopniu determinować aktywność komórkową. Co więcej, względnie statyczne ligandy na powierzchniach nie mogą odzwierciedlać dynamiki w kontaktach komórka-ECM.

Ponieważ osadzanie białek na powierzchni w sposób przypadkowy nie będzie w stanie określić ich interakcji z komórkami, wymagana jest dobrze scharakteryzowana platforma. W celu zbadania aktywności komórkowej w tkankach, taka platforma powinna wykazywać wiele funkcji, takich jak zdolność do immobilizacji specyficznych ligandów, zapobieganie mylącym aktywnościom komórkowym indukowanym przez zaadsorbowane białka nie będące celem, oraz prezentowanie rozszerzonej i uwodnionej struktury przypominającej ECM. W związku z tym, funkcjonalizowalne i niefoulingowe właściwości podłoży stają się istotne jako platforma dla wzrostu komórek. Spośród wielu materiałów niebiofoulingowych, które mogą silnie opierać się niespecyficznej adsorpcji białek (Ishihara et al., 1998; Chen et al., 2010; Jiang and Cao, 2010), materiały na bazie lipidów są uważane za najlepsze dla systemów biologicznych, ponieważ tworzą mikrośrodowisko podobne do błony komórkowej do badania interakcji komórka-komórka i komórka-biomateriał. W szczególności, złożone interakcje komórka-komórka i komórka-biomateriał są bardzo dynamiczne z szerokim zakresem biomolekuł w sposób kontrolowany przestrzenno-czasowo, takie jak złożone wewnątrzkomórkowe procesy sygnalizacyjne i reorganizacja strukturalna. Nie są one w stanie być prowadzone przez statyczne systemy SAM. W celu monitorowania złożoności błony komórkowej i związanych z nią procesów in vitro, opracowywane są dynamiczne materiały syntetyczne, w których możliwa jest kontrola właściwości ligandów, takich jak ruchliwość, gęstość i prezentacja. Modelowe błony komórkowe, podtrzymywane dwuwarstwy lipidowe (SLBs), oferują podejście bottom-up do konstruowania dynamicznych funkcjonalnych biointerfejsów, aby umożliwić samoorganizację i mobilność ligandów, prezentację i dystrybucję w określonych miejscach (Kocer i Jonkheijm, 2018). Dlatego też w niniejszym artykule skupiono się na rozwijaniu kontaktów komórka-ECM przy użyciu funkcjonalnych SLBs, aby wyjaśnić złożone dynamiczne zachowania w celu wykorzystania kluczowych cech błon komórkowych i ich interakcji z ECMs. W oparciu o SLBs, badania skonstruowały funkcjonalne SLB modyfikowane małymi cząsteczkami, takimi jak peptyd RGD (Svedhem i in., 2003; Jensen i in., 2004; Ochsenhirt i in., 2006) i naskórkowy czynnik wzrostu (Nam i in., 2006) w celu kontroli odpowiedzi komórkowych. Jednakże, aby poszerzyć zakres i złożoność mikrośrodowiska, układ biomimetyczny skonstruowany poprzez sprzężenie białek ECM z funkcjonalizowanym SLB może być bardziej odpowiedni do zilustrowania interakcji pomiędzy składnikami ECM a komórkami. Płynność, gradient, właściwości mechaniczne, nanostruktury, oddziaływania międzycząsteczkowe (np. kolagen-fibronektyna) i wewnątrzcząsteczkowe (np. fibrylogeneza kolagenu) składników ECM na SLB mogą być definiowane i oceniane w celu zbadania rzeczywistych odpowiedzi komórkowych w mikrośrodowisku, odróżniając w ten sposób ten rodzaj platformy do hodowli komórek od innych platform na ciałach stałych, takich jak tworzywa sztuczne, metale, tlenki i SAM. Dlatego, SLB oferuje solidną platformę z unikalnymi właściwościami podobnymi do błony komórkowej, takimi jak nieporastanie, hydratacja, dyfuzja boczna i zdolność do kontrolowania lokalizacji przestrzennej i gęstości ligandów dla wielkiego potencjału w naukach medycznych i inżynierii (Sackmann, 1996; Groves et al., 2001).

Extracellular Matrix-Supported Lipid Bilayer Systems

Pionierskie prace dotyczące biomimetycznego systemu hodowli komórkowej opartego na SLB sprzężonym z ECM zostały przeprowadzone przez grupę Changa (Huang et al., 2010b). Skonstruowali oni biomimetyczną platformę poprzez funkcjonalizację kolagenu typu I na SLBs, aby służyć jako podłoże do weryfikacji hodowli komórkowych i badania zachowań komórek, Funkcjonalizowalne pęcherzyki lipidowe składające się z 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-(glutarylu) (DP-NGPE) i 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (POPC) osadzono na podłożu SiO2 tworząc SLBs (rysunek 1). Ułamek molowy DP-NGPE, fosfolipidu funkcjonalizowanego kwasem karboksylowym, w SLBs był zróżnicowany od 0 do 40%. W celu wytworzenia funkcjonalizowanej kolagenem typu I dwuwarstwy lipidowej, do komory wprowadzono natywne cząsteczki kolagenu typu I, które reagowały z aktywowanymi lipidami DP-NGPE i tworzyły stabilne koniugaty kolagen-lipid z wiązaniami amidowymi poprzez chemię sprzęgania aminowego. Kinetykę wiązania unieruchomionych białek oraz charakterystykę błony – grubość, lepkosprężystość, konformację i płynność – monitorowano za pomocą mikrowagi kwarcowej z dyssypacją (QCM-D), mikroskopii sił atomowych (AFM) oraz odzysku fluorescencji po fotobieleniu (FRAP). Wyniki badań wykazały, że kolagen zaadsorbowany na sfunkcjonalizowanych SLB o wysokiej zawartości DP-NGPE zwiększa ich masę powierzchniową, lepkosprężystość i zdolność do samoorganizacji w struktury fibrylarne. Dane z FRAP wskazują, że boczna ruchliwość lipidów była zredukowana nawet o 20% po przyłączeniu kolagenu typu I do SLBs. Komórki mię¶ni gładkich (A10) rozprzestrzeniały się i rosły na sfunkcjonalizowanej kolagenem platformie w sposób regularny, w przeciwieństwie do warstwy POPC/DG-NGPE bez kolagenu i gołej warstwy lipidowej POPC. Prosty system biomimetyczny typu bottom-up, zawierający kluczowe składniki błony plazmatycznej i ECM, oferuje możliwość ujawnienia komórkowego rozpoznania i odpowiedzi na elementy ECM i wskazówki fizyczne.

W uzupełnieniu do badań punktowo-rozdzielczych, ewolucyjne odpowiedzi komórkowe na system ECM-SLB zostały zbadane przez tę samą grupę (Huang et al., 2010c). W badaniu tym, biomimetyczne mikrośrodowiska ECM zostały wytworzone przez koniugację kolagenu typu I i/lub fibronektyny na funkcjonalizowanych SLBs zawierających aktywowane DP-NGPE (Rysunek 2). Sprzężone z białkami układy scharakteryzowano ilościowo metodą QCM-D pod względem masy powierzchniowej, lepkosprężystości oraz oddziaływań kolagen-fibronektyna. Opóźnienie ruchliwości SLB po koniugacji z białkiem i hodowli komórkowej wykazano metodą FRAP. Fibroblasty NIH 3T3 hodowano na konstruktach ECM-SLB oraz na polistyrenie poddanym działaniu plazmy tlenowej (PSo) w celu równoległego porównania. W hodowlach ECM-SLB największą liczbę komórek i wielkość rozsiewu fibroblastów stwierdzono na SLB osadzonych na fibronektynie. Na PSo pokrytych ECM nie zaobserwowano jednak tak wyraźnych różnic w zawartości wszystkich białek. Ponadto, wyniki barwienia immunofluorescencyjnego wykazały, że poziom adsorpcji fibronektyny, endogennie produkowanej przez komórki 3T3, na powierzchniach PSo był wyraźnie wyższy niż na platformach SLB. Wyniki te podkreślają ważną rolę przeciwporostowej natury SLB w zapobieganiu efektywnej przebudowy mikrośrodowiska przez komórki 3T3. Przeciwnie, komórki mogą łatwo remodelować poprzez niespecyficzną adsorpcję białek ECM na platformach opartych na PSo. W konsekwencji, platforma ECM-SLB może być wykorzystana do monitorowania i regulacji specyficznych odpowiedzi komórek na kompozycje ECM i późniejsze zdarzenia sygnalizacyjne ze środowiskami pozakomórkowymi.

Grupa Cho badała zachowanie komórek na SLB o niskiej sztywności, funkcjonalizowanych fibronektyną lub kolagenem typu I poprzez chemię sprzęgania amin (Vafaei et al., 2017a). Tradycyjnie, plastikowe płytki do hodowli komórek wykazują niezwykle sztywne podłoże, które nie może odzwierciedlać rzeczywistej sztywności mechanicznej doświadczanej przez komórki w fizjologicznych mikrośrodowiskach. Ostatnio, elastomery, takie jak polidimetylosiloksan (PDMS), zostały użyte do modulowania szerokich reżimów sztywności, aby dostarczyć wielu ważnych informacji na temat roli właściwości mechanicznych ECM w odpowiedzi komórkowej (Engler i in., 2006). Niemniej jednak, systemy SLB oferują możliwość dostępu do najbardziej miękkich i płynnych interfejsów w celu monitorowania aktywności komórek w środowisku fizjologicznym. Pęcherzyki lipidowe składały się ze zwitterionowej 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfatydylocholiny (DOPC) i DP-NGPE, które następnie osadzano na szkiełkach nakrywkowych SiO2 metodą tworzenia warstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB) (Tabaei i in., 2014; Vafaei i in., 2017b). W odróżnieniu od konwencjonalnej metody syntezy pęcherzyków, która obejmuje spontaniczną adsorpcję i rozerwanie pęcherzyków fosfolipidowych i jest ograniczona tylko do podzbioru kompozycji lipidowych i stałych nośników (Huang i in., 2010a,b,c), metoda tworzenia SALB opiera się na zjawisku parowania w fazie odwróconej i obejmuje osadzanie lipidów na hydrofilowej powierzchni stałej w alkoholu (Tabaei i in., 2014). Metoda SALB została z powodzeniem zastosowana do szerokiej gamy podłoży, takich jak Au, Al2O3 i grafen, które są nie do pokonania przez metodę konwencjonalną (Tabaei i in., 2014; Jackman i in., 2015). Białka ECM kolagenu typu I i fibronektyny zostały chemicznie skoniugowane na SLB wspomaganych przez SALB. Przeprowadzono badania QCM-D i stwierdzono, że ECM na SLB są mniej gęste i mają większą elastyczność strukturalną niż po adsorpcji na SiO2 (Vafaei et al., 2017b).

Ponadto, oparte na SLB podłoże o niskiej sztywności zostało sfunkcjonalizowane kolagenem typu I lub fibronektyną do badań adhezji komórek (Vafaei et al., 2017a). Płynność boczna SLB była precyzyjnie dostrajana poprzez kontrolowanie frakcji molowej DP-NGPE i cholesterolu w SLB. Specyficzna adhezja komórek na dwuwarstwie, z obrazów fluorescencyjnych, była wskazywana przez wzbogacenie białek ECM i pojawienie się strefy zubożenia wokół komórek. Na dwuwarstwach o wysokiej zawartości cholesterolu, >10% komórek wykazywało zubożenie fibronektyny lub kolagenu. Przypisuje się to zmniejszonemu ruchowi poprzecznemu białek ECM, który jest kontrolowany przez lepkość leżącej pod spodem dwuwarstwy. Dlatego też, platforma ECM-SLB z dodatkiem cholesterolu zapewnia zakres sztywności podłoża dla potencjalnych zastosowań biomedycznych, które wymagają adhezji komórek do powierzchni o bardzo niskiej sztywności, takich jak tkanki neuronów.

W celu opracowania platformy, która jest bardziej zbliżona do mikrośrodowiska komórkowego, SLB został sfunkcjonalizowany z naturalną zdekomularyzowaną macierzą pozakomórkową (dECM), która zachowuje 3D-ultrastrukturę i wspiera przeżycie i przywiązanie ludzkiego hepatocytu Huh 7.5 (Figura 3) (Vafaei i in., 2018). DECM został wyodrębniony z kadawerów myszy i został zdekomórkowany przy użyciu mieszaniny roztworu chloroformu/metanolu. DECM zawiera GAGs, kolagen i fibronektynę. Komponenty dECM zostały chemicznie przyłączone do SLB zawierającego DP-NGPE i DOPC za pomocą chemii sprzęgania aminowego. QCM-D wykorzystano do monitorowania procesu formowania się dwuwarstwy oraz kinetyki osadzania dECM. Wyniki FRAP potwierdziły płynność membrany po funkcjonalizacji dECM. Platforma wspiera przetrwanie i przyczepianie się komórek oraz utrzymuje reprezentatywną funkcję wątrobokomórkową. Uderzające jest to, że na platformie zaobserwowano boczne grupowanie i organizację receptorów czynników wzrostu i ligandów wiążących komórki w obecności pochodzących z tkanek składników dECM o bogatym profilu biochemicznym.

Hao i wsp. donieśli o wpływie właściwości mechanicznych ECM-SLB na różnicowanie neuronalnych komórek macierzystych (NSCs) (Hao i wsp., 2018). SLBs zostały użyte jako platforma hodowlana, aby naśladować dynamiczne właściwości płynnej ECM. Płynność SLBs była precyzyjnie zróżnicowana przez właściwości powierzchniowe podłoży. SLBs zawierają 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanolaminę-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoksadiazol-4-yl) (NBD-PE), 1,2-dimyristoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DMPC) i 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanolaminę-N-(sukcynyl) (Succinyl-PE). Z pomiarów FRAP wynika, że SLB na szkle traktowanym piranią (P-SLB) wykazuje większą płynność w porównaniu z SLB na szkle modyfikowanym wiązaniami chloroformianu cholesterolu (CC-SLB) lub chitozanu (Cs-SLB). Ponadto, płynność CC-SLB była nieco niższa niż Cs-SLB. Fibronektyna była następnie fizycznie adsorbowana na SLBs na różnych podłożach. Uzyskane wyniki wskazują, że zachowanie NSCs było silnie związane z płynnością SLBs. Zwiększoną adhezję ogniskową, rozciągniętą i wydłużoną morfologię komórek, gęstą sieć włókien naprężeniowych i zwiększone różnicowanie neuronów zaobserwowano na SLB o niskiej płynności. Przeciwnie, na SLB o dużej płynności stwierdzono mniejsze tworzenie się ognisk adhezji, okrągłą morfologię komórek, niedojrzałe włókna naprężeniowe i większe różnicowanie astrocytów. W badaniach mechanistycznych wykazano, że aktywacja szlaków sygnałowych FAK-MEK/ERK jest kluczową drogą do zwiększonego tworzenia ognisk adhezji i ostatecznie promuje różnicowanie neuronalne NSCs na SLB o niskiej płynności. Praca ta dostarczyła wglądu w wpływ dynamicznej ECM na zachowanie komórek macierzystych, jak również poprawiła skuteczność zastosowań komórek macierzystych.

Tethered liposomes on SLBs zostały ustanowione dla hybrydyzacji DNA (Benkoski i Hook, 2005; Yoshina-Ishii et al., 2005), wiązania biotyny ze streptawidyną (Patel et al., 2009) i dostarczania leków (Tseng i Chang, 2012). Systemy liposomów na uwięzi zastosowano do rekonstytucji białek membranowych w celu badania interakcji białko-lipid i białko-białko, jak również do enkapsulacji białek w celu detekcji pojedynczych biomolekuł. Biomimetyczna konstrukcja zawierająca ECM-SLBs została utworzona z glikolu polietylenowego (PEG), fibronektyny i liposomów zawierających cholesterol (Tseng i Chang, 2012). SLBs były zbudowane z funkcjonalnego 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-kap-biotynylu (b-PE) i zwitterionowego POPC. Liposomy otoczone lekiem zostały unieruchomione dzięki interakcji biotyna-streptawidyna (rysunek 4). Konstrukcja liposom-SLB służy jako wielofunkcyjna platforma do uwalniania leków i przyłączania komórek. Tworzenie się modelowej platformy fibronektyna-liposom-SLB było monitorowane in situ za pomocą QCM-D. Doskonała stabilność liposomów wiązanych powierzchniowo na SLBs została zbadana za pomocą kapsułkowanej sondy fluorescencyjnej. Wykazano, że < 20% zawartości sondy fluorescencyjnej zostało uwolnione w ciągu 8 dni. Komórki HeLa były hodowane na platformie fibronektyna-liposomy-SLB w celu zbadania interakcji komórkowych. Stwierdzono, że fibronektyna jest krytyczna dla zwiększenia adhezji komórek HeLa na platformach. Dlatego też, po przylgnięciu komórek, liposomy ulegały przestrzennej reorganizacji i były pochłaniane przez komórki. Gęstość powierzchniowa liposomów zawierających doksorubicynę determinuje apoptozę komórek HeLa, potwierdzając efektywność dostarczania leku przez liposomy. Dlatego też, wielofunkcyjna platforma modelowa może być korzystna jako wstępnie podawany, kontrolowany system uwalniania dla badań opartych na komórkach i tkankach.

W uzupełnieniu do białek ECM, GAGs wykazują wiele funkcji w tkankach, w tym zapewniając wsparcie, pośrednicząc w różnicowaniu i podziale komórek oraz biorąc udział w ważnych interakcjach z białkami. Zrozumienie interakcji związanych z GAG jest z natury trudne i wymaga odpowiednich i zdefiniowanych platform. Svedhem i wsp. przedstawili dwie strategie immobilizacji w celu chemicznego sprzężenia GAG – siarczanu chondroityny (CS) z płynnymi SLB: 1. poprzez aktywację grup karboksylowych na CS przed dodaniem aminofunkcjonalizowanego lipidu, tj, 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę-N-(lauroilaminę) (DOPE-NH2); 2. poprzez aktywację karboksyfunkcjonalizowanych fosfolipidów, takich jak 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(lauroil) (DOPE-COOH), a następnie dodanie hydrazydu-funkcjonalizowanego CS (Altgarde i in., 2013). Tworzenie się SLBs i następującą po nim koniugację śledzono in situ za pomocą QCM-D. Wyniki pokazują, że obie strategie pozwoliły na uzyskanie cienkich warstw CS o podobnych właściwościach lepkosprężystych. Koniugacja CS nie miała wpływu na płynność dwuwarstwy lipidowej. Tak więc, zastosowanie opracowanej platformy CS na SLBs zostało zilustrowane dla indukującego wzrost kości czynnika wzrostu białka morfogenetycznego kości-2.

Summary and Outlook

Ustalenie mikrośrodowisk dla wzrostu i regulacji komórek in vitro pozostaje wyzwaniem. Złożoność ECMs była nieobecna w zwykłych systemach hodowli komórkowych, co obejmuje płynność, gradient, właściwości mechaniczne, nanostruktury oraz interakcje między- i wewnątrzcząsteczkowe. Biomimetyczny system SLB skoniugowany ze składnikami ECM rzuca pewne światło na rzeczywiste odpowiedzi komórkowe w mikrośrodowisku in vivo. SLB zapewnia unikalną charakterystykę płynności, odporności na zacieranie, wszechstronności i biokompatybilności. Do tej pory nie znaleźliśmy żadnej alternatywy, która mogłaby być wykorzystana do tego samego celu. Właściwości fizyczne platform SLB-ECM mogą być jasno zdefiniowane poprzez zastosowanie zaawansowanych instrumentów, takich jak QCM-D, AFM i FRAP, w celu korelacji odpowiedzi komórkowych. Ponadto, dynamiczne zachowania komórek na platformach SLB-ECM powinny być warte śledzenia, ponieważ skład i struktura ECM trwale zmieniają się wraz ze wzrostem komórek. Na platformie SLB-ECM badacze mogą obserwować specyficzne interakcje rozpoznawcze pomiędzy komórkami i ich mikrośrodowiskiem, co pozwala na bezpośrednie przełożenie aktywności biologicznej na sztuczny system hodowlany. Poza badaniami podstawowymi, uważa się, że platforma SLB-ECM może być przydatna w różnych zastosowaniach, takich jak badania przesiewowe leków, wychwytywanie rzadkich komórek, medycyna regeneracyjna i biosensing.

Wkład autorów

C-JH jest odpowiedzialny za wyszukiwanie literatury i pisanie. Y-CC jest odpowiedzialny za pisanie i korektę.

Funding

MOST 105-2628-E-008-007-MY3; 106-2119-M-194-002; 107-0210-01-19-01; 107-2119-M-001-039 z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST), Tajwan, i Academia Sinica, Tajwan.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy deklarują, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych relacji, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

We acknowledge the Ministry of Science and Technology (MOST 105-2628-E-008-007-MY3; 106-2119-M-194-002; 107-2119-M-001-039) for financial support of this project.

.