Komórkowe i molekularne odpowiedzi na ostre traktowanie kokainą w neuronopodobnych komórkach N2a: potential mechanism for its resistance in cell death

Materiały

Hodowla komórek

Komórki N2a (CCL-131, ATCC) były utrzymywane jako hodowla jednowarstwowa48, i były szeroko stosowane w badaniach nad substancjami nadużywanymi14,49,50 lub zaburzeniami OUN, takimi jak choroba Parkinsona51 lub Alzheimera47,52,53. Jedną z zalet tej linii komórkowej jest to, że drobne zmiany morfologiczne spowodowane ekspozycją chemiczną mogą być łatwo wykryte ze względu na większy rozmiar komórek. O ile nie określono inaczej, wszystkie eksperymenty w naszym badaniu przeprowadzono w wolnym od czerwieni fenolowej podłożu RPMI-1640 zawierającym 10% FBS. Posiane komórki na płytkach lub szalkach hodowlanych mogły rosnąć 4-5 dni w inkubatorze w celu spontanicznego różnicowania się wyrostków neurytowych. Wszystkie badania powtarzano co najmniej dwukrotnie.

Morfologia

Do oceny morfologicznej komórek brutto, komórki barwione fioletem krystalicznym37 były fotomikrografowane przy użyciu EVOS Cell Imaging Systems z obiektywem ×40. W niektórych badaniach, morfologia lub wakuole komórek barwionych fioletem krystalicznym zostały pobrane przy użyciu odwróconego mikroskopu IX-70 Olympus z kontrastem fazowym. Wyrośla neurytów zostały określone ilościowo przy użyciu oprogramowania image J (National Institutes of Health).

Elektrofizjologia

Whole-cell patch clamp był używany do nagrywania z komórek N2a hodowanych na plastikowych szkiełkach nakrywkowych. Szkiełka nakrywkowe przemywano trzykrotnie roztworem do rejestracji zewnątrzkomórkowej zawierającym (w mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glukozy i 10 HEPES (312 mOsm, pH 7.4) i inkubowano w tym roztworze w temperaturze pokojowej. Podczas rejestracji szkiełka nakrywkowe pozostawiano bez obróbki lub poddawano działaniu 6,25 μM lub 4 mM kokainy bezpośrednio w roztworze zewnątrzkomórkowym. Elektrody szklane (opór 1-5 MΩ) wypełniano roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym (w mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES i 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4). Komórki wizualizowano w kontraście fazowym za pomocą mikroskopu odwróconego Nikon Eclipse Ti-U i dołączonej monochromatycznej kamery cyfrowej DS-Qi1.

Zapisy wykonywano za pomocą wzmacniacza Axopatch 200B (Molecular Devices, CA) i digitalizowano za pomocą systemu Digidata 1440A (Molecular Devices, CA). Prądy jonowe były rejestrowane w protokole zacisku napięciowego (-60 do 135 mV w krokach 15 mV, czas trwania 250 ms). Spontaniczne prądy postsynaptyczne rejestrowano w ciągłym zacisku napięciowym przy -80 mV przez 2 min. Protokół klamry prądowej (-100 do 200 pA w krokach co 20 pA, czas trwania 800 ms) był używany do oceny zdolności komórek N2a do wywoływania potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu. Sygnały były filtrowane z częstotliwością 1 kHz i próbkowane z częstotliwością 10 kHz. Dane zbierano i analizowano przy użyciu oprogramowania pCLAMP 10 (Molecular Devices, CA).

Traktowania

Znaną ilość chlorowodorku kokainy rozpuszczono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako 1 M zapas tuż przed badaniami. W celu symulowania farmakologicznych stężeń kokainy in vivo, wynoszących od 1 nM do 6,25 μM, w PBS przygotowano kilka roztworów roboczych (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200 i 400 μM); podobnie w przypadku wyższych stężeń kokainy (2, 3 i 4 mM końcowe) w PBS przygotowano roztwory robocze o stężeniach 80, 120 i 160 mM. Z każdego zapasu roboczego dodano 5 μl kokainy do każdej studzienki w celu osiągnięcia pożądanych stężeń, jak również w celu zapobieżenia zmianom pH w podłożu hodowlanym37. Ostateczna objętość w każdej studzience wynosiła 200 μl. Podczas gdy wybór niższych stężeń był oparty na sprawozdaniach dotyczących kokainy w stężeniach od nano do mikro molowych w komórkach OUN osób uzależnionych13 , wyższe stężenia były oparte na kilku badaniach in vitro14,15,16. Komórki z samą pożywką lub równą objętością nośnika (PBS) w pożywce służyły jako kontrole, natomiast pożywkę pozbawioną komórek potraktowano jako ślepą próbę. W oparciu o nasze wcześniejsze badania na komórkach C6 astroglia-like6 , leczenie kokainą w obecnym badaniu było również prowadzone przez 1 h dla celów porównawczych. Nawiasem mówiąc, działanie kokainy u osób uzależnionych słabnie w tym czasie przy typowych ilościach i drogach przyjmowania33. W podzbiorze eksperymentów, komórki w 96 dołkowych płytkach były wstępnie traktowane 1 µM YM155, inhibitorem genu survivin, przez 30 min, a następnie poddawane współtoksykacji kokainą (2-4 mM) przez 1 h i oceniane pod kątem żywotności komórek, podczas gdy w innych badaniach komórki były wstępnie traktowane 5 μM PIK-75, inhibitorem Nrf-224, przez 30 min przed współtoksykacją kokainą (2-4 mM) przez 1 h i oceniane pod kątem żywotności komórek i poziomu GSH.

Żywotność i wakuolizacja

Żywotność komórek oceniano przez barwienie fioletem krystalicznym, jak opisano wcześniej54,55. Stopień wakuolizacji w komórkach określono ilościowo w komórkach utrwalonych glutaraldehydem poprzez wychwyt barwnika czerwieni obojętnej, jak opisano wcześniej56. Barwnik ekstrahowano za pomocą 70% etanolu i 0,37% kwasu solnego, a absorbancję przy 540 nm mierzono w czytniku płytek. Komórki wybarwione fioletem krystalicznym wykorzystano do fotomikrografowania wakuoli za pomocą odwróconego mikroskopu fazowego IX-70 Olympus z obiektywem ×40.

Mikroskopia wideo

Do wideografii na żywo, jeden z obiektywów okularowych odwróconego mikroskopu fazowego IX-70 Olympus zastąpiono standardowym okularowym systemem kamery wideo. Wylot złącza wideo był podłączony do komputera w celu wizualizacji obrazu na monitorze przy użyciu oprogramowania Electronic Ocular -R-AMCap, dostarczonego przez Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, Chiny). Dokumentacja wideo została wykonana z prędkością 14 klatek na sekundę.

Cell membrane integrity assay

Cell membrane integrity was determined by measuring the release of cytoplasmic LDH with CytoTox 96 non-radioactive assay kit (Promega, Madison, WI) as per the instructions provided by the manufacturer. W skrócie, komórki w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych poddawano działaniu różnych stężeń kokainy (2, 3 i 4 mM) przez 1 h. Następnie 50 μl badanego medium przenoszono do nowej 96-dołkowej płytki, mieszano z równą objętością mieszaniny substratów z zestawu i inkubowano przez 30 min w temperaturze 37 °C. Absorbancję mierzono w czytniku płytek przy długości fali 490 nm.

Pomiar wewnątrzkomórkowych ROS

Komórki na płytkach 96-dołkowych poddawano działaniu kokainy w stężeniach 2, 3 i 4 mM przez 1 h, a następnie barwiono barwnikiem przepuszczalnym dla komórek H2DCFDA (10 μM finalnie) przez 30 min6. Po delikatnym przemyciu i wysuszeniu komórek powietrzem dodano PBS (100 μl/basenik). Płytki odczytywano z filtrem wzbudzenia ustawionym na 485 nm i filtrem emisji na 530 nm w automatycznym czytniku (BioTek™ Synergy HTX multimode micro plate reader, BioTek Instruments, Winooski, VT).

Atest peroksydacji lipidów

Komórki wysiewano w początkowej gęstości 0,3 × 106 komórek na studzienkę w sześciodołkowych płytkach. Peroksydację lipidów mierzono zgodnie z wcześniejszym opisem57. W skrócie, po traktowaniu kokainą w stężeniach 2, 3, i 4 mM przez 1 h, komórki zbierano i odwirowywano przy 13 000 obr/min w mikrowirówce stołowej przez 6 min. Wszystkie osady komórkowe poddano sonikacji w PBS na lodzie przez 3 s i przeniesiono do szklanych probówek. Następnie lizaty mieszano z 30% kwasem trójchlorooctowym, 0,37% kwasem tiobarbiturowym (TBA). Mieszaninę gotowano przez 10 min, schłodzono do temperatury pokojowej (RT), przeniesiono do nowych probówek sokołowych i wirowano przy 3038 × g przez 10 min. Klarowny supernatant przenoszono na płytkę 96-dołkową i mierzono absorbancję przy 535 nm w czytniku mikropłytek. Czyste medium bez komórek wykorzystano jako ślepą próbę.

Ogólna mitochondrialna aktywność metaboliczna i potencjał błonowy

Komórki (2 × 104) traktowano różnymi stężeniami kokainy (2, 3, i 4 mM) przez 1 h w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. Następnie płytki odwirowano przy 304 × g przez 4 min, a pożywkę zawierającą kokainę ostrożnie odrzucono. Po natychmiastowym dodaniu świeżej pożywki do komórek (200 μl) dodano 10 μl MTS (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5(3-karboksymetonofenol)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium, Promega) na studzienkę, jak podano wcześniej58 i inkubowano przez 30 min w temperaturze 37 °C. Absorbancję mierzono w czytniku mikropłytek przy długości fali 490 nm. Potencjał membranowy oznaczano zgodnie z wcześniejszą procedurą46. Pod koniec 1 h traktowania kokainą, jednowarstwowe komórki pokrywano 100 μl 0,25% wodnego glutaraldehydu w celu utrwalenia, zawierającego Rh 123 w celu uzyskania końcowego stężenia 2,6 μM przez 30 min w RT. Supernatant wyrzucano, a płytki przemywano wodą i suszono na powietrzu w kapturze. Na koniec dodano 100 μl 0,1% Triton×100 w PBS do każdej studzienki i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 1 h. Płytki odczytywano z filtrem wzbudzenia ustawionym na 485 nm i filtrem emisji na 538 nm na wielomodowym czytniku mikropłytek BioTek™ Synergy™ HTX.

Detekcja mleczanu

Badania przeprowadzone na komórkach hodowanych w podłożu zawierającym 10% FBS dały wysokie wartości tła z powodu interakcji surowicy z niektórymi składnikami zestawu (Trinity Biotech, Jamestown, NY). Tak więc w naszych kolejnych badaniach, przed zabiegami, pożywka zawierająca 10% FBS została zastąpiona zredukowaną surowicą (0,1% FBS) w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych (2 × 104 komórki na dołek). Odczynnik zestawu rozpuszczono w roztworze chromogenicznym, który składał się z 5,3 mM kwasu wanilinowego, 2,9 mM 4-amino antypiryny i około 4 jednostek peroksydazy chrzanowej. Pod koniec 1 h traktowania kokainą, odczynnik zestawu dodawano bezpośrednio do dołków (20 μl na 200 μl), a płytki trzymano w inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu rozwinięcia koloru (5-10 min). Absorbancja z nietraktowanych komórek była brana jako kontrola, podczas gdy pożywka pozbawiona komórek była brana jako ślepa próba. Absorbancja była mierzona przy 490 nm w czytniku mikropłytek.

Spektroskopia NMR

Uwolnienie mleczanu z komórek było wykrywane przez protonową (1H+) spektroskopię NMR. Ponieważ ilość surowicy nie przeszkadza w tej metodzie, użyliśmy 10% FBS w pożywce w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych (2 × 104 komórki/200 μl na dołek). Pod koniec 1 h traktowania kokainą, pożywka (0,15 ml na studzienkę) ze wszystkich powtórzeń (n = 12) każdego traktowania została połączona (1,8 ml) w oznakowanych probówkach. Pożywka z komórek nie poddanych działaniu substancji została użyta jako kontrola. Ponieważ próbki poddane działaniu substancji zawierały 2-4 mM kokainy, dodaliśmy kokainę (4 mM finalnie) do ślepej pożywki. Analizy NMR przeprowadzono na aparacie Bruker Avance 800 (częstotliwość = 800,23 MHz) wyposażonym w krioprobe TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z (maksymalne natężenie gradientu pola z wynosi 48 G/cm). W celu uzyskania jednowymiarowego (1D) widma NMR dokonano akwizycji i koaddycji 16 transjentów z 3 s opóźnieniem akwizycji. Punkty danych (32 000) zostały użyte do uzyskania widma o szerokości 7500 Hz. Dominujący pik wody znajdujący się przy 4.75 ppm w widmie został wyeliminowany przy użyciu sekwencji impulsów WATERGATE W520. Szerokość pasma 3000 Hz po każdej stronie piku wody została określona jako okno spektralne do obserwacji pików solutu poprzez zastosowanie czasu opóźnienia 333.3 μs dla ciągów impulsów WATERGATE. Przygotowano zewnętrzny wzorzec, 3,3 mM wodny roztwór DMSO, do ilościowego oznaczenia mleczanu w roztworze próbki.

Pomiar H2S w podłożu hodowli komórkowej

Komórki posiano w początkowej gęstości 2 × 104 na studzienkę w płytkach 96-studzienkowych. Przed traktowaniem kokainą do komórek dodawano 1,64% wodny octan cynku59,60 (ostatecznie: 0,041%), aby przekształcić lotny gaz H2S w siarczek cynku podczas traktowania kokainą. Po 1 h traktowania 2, 3 i 4 mM kokainy do dołków dodawano 17,453 mM siarczanu N,N-dimetylo-p-fenylenodiaminy w 7,2 M HCl (ostatecznie: 2,55 mM) i 26,18 mM FeCl3 w 1,2 M HCl (ostatecznie: 3,83 mM) i delikatnie worteksowano. Pęcherzyki w podłożu usunięto przez dodanie 5 μl zimnego etanolu do wszystkich dołków tuż przed odczytem płytek przy 670 nm w czytniku mikropłytek.

Test bioluminescencji ATP

Komórki w 96 dołkowych płytkach mikrotitracyjnych traktowano różnymi stężeniami kokainy (2, 3 i 4 mM) przez 1 h. Całkowity ATP był mierzony przy użyciu zestawu do oznaczania komórek somatycznych Bioluminescent ATP (FLASC, Sigma-Aldrich) zgodnie z instrukcjami zestawu dostarczonymi przez producenta. W skrócie, pod koniec obróbki, do każdej studzienki dodawano 75 μl roztworu uwalniającego ATP z komórek somatycznych, aby zlizywać komórki. Następnie 50 μl lizatu przenoszono do nowych białych płytek 96-dołkowych z przezroczystym dnem, które zawierały już 50 μl mieszaniny enzymów do oznaczania ATP w świetle zredukowanym. Luminescencję mierzono natychmiast na wielomodowym czytniku mikropłytek BioTek™ Synergy™ HTX.

Isolacja RNA i synteza cDNA

Komórki wysiewano w gęstości 2 × 106 w szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm. W czasie traktowania, komórki osiągnęły około 65-70% konfluencji. Po 1 h traktowania 2-4 mM kokainy, komórki zbierano przez zeskrobanie i odwirowywano przy 1125 × g przez 5 min. Całkowite RNA wyizolowano zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta (Qiagen Sciences, German town, MD) przy użyciu kolumn RNeasy mini spin. Kolumnę potraktowano DNazą I (Qiagen Sciences). Całkowite RNA z kolumny eluowano za pomocą 20 μl wody wolnej od RNazy. W celu oznaczenia ilościowego, RNA na lodzie rozcieńczano w wodzie wolnej od RNazy w stosunku 1:10. Ilość całkowitego RNA mierzono za pomocą spektrofotometru Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). RNA wykazywał stosunek >1,95 przy 260/280 nm, a następnie był używany do syntezy cDNA. Jeden mikrogram całkowitego RNA został użyty do wytworzenia cDNA przy użyciu zestawu do syntezy iScript cDNA (Bio-Rad, Hercules, CA) zgodnie z instrukcjami producenta.

Relative expression by quantitative RT-PCR

Analizę ekspresji genów Nrf-2, survivin (Birc5), i GAPDH metodą qPCR przeprowadzono w termocyklerze iCycler z systemem detekcji MyiQ (Bio-Rad) przy użyciu supermiksu iQ SYBR Green. Produkty Nrf-2, survivin i GAPDH były syntetyzowane w oddzielnych reakcjach PCR, przeprowadzanych w 20 μl objętości końcowej z 2 μl próbki cDNA i 500 nM specyficznych primerów. Warunki cykliczności były następujące: 95 °C przez 10 min, a następnie 40 cykli w 95 °C przez 15 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, natomiast analizę krzywej topnienia po PCR przeprowadzono w temperaturze 55-95 °C. Względną kwantyfikację ekspresji genów przeprowadzono zgodnie z metodą 2-△△CT61 z GAPDH jako kontrolą endogenną. Sekwencje primerów użyte do analiz przedstawiono w Tabeli 1.

Total GSH assay

Po traktowaniu różnymi stężeniami kokainy (2-4 mM) w kompletnej pożywce przez 1 h w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych, komórki utrwalano 0,25% aldehydem glutarowym przez 30 min, po czym trzykrotnie delikatnie przemywano i suszono na powietrzu. Całkowity komórkowy GSH został oznaczony zgodnie z wcześniejszym opisem62. Absorbancja była mierzona przy 412 nm w czytniku mikropłytek.

Przygotowanie lizatów całokomórkowych

Do oznaczeń enzymatycznych, komórki były wysiewane w gęstości 2 × 106 w szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm. Po 1 h traktowania 2-4 mM kokainy, komórki zbierano przy użyciu skrobaków komórkowych. Po odwirowaniu przy 1620 × g przez 5 minut, granulki komórkowe przechowywano w temperaturze -70 °C do dalszego wykorzystania. W dniu przeprowadzania testów, granulki ponownie zawieszano w 0,5 ml PBS i sonikowano dwukrotnie na lodzie przez 15 s. Zawartość przenoszono do probówek eppendorfa i mikrowirowano przy 5000 rpm przez 5 min. Supernatanty przenoszono do nowych probówek i używano do oznaczeń enzymatycznych. Stężenie białka w każdym lizacie oznaczano przy użyciu zestawu do oznaczania białka BCA (Pierce, Rockford, IL) zgodnie z instrukcjami producenta, przyjmując albuminę surowicy bydlęcej jako standardową referencję.

Atest katalazy

Określano zgodnie z wcześniejszą metodą63. Mieszanina reakcyjna (450 μl) w kuwecie kwarcowej zawierała 50 μl lizatu komórkowego (60 μg), 250 μl 50 mM buforu fosforanowego (pH 7,0). Reakcję rozpoczęto przez dodanie 150 μl 30 mM H2O2 (10 mM finalnie). Spadek absorbancji przy długości fali 240 nm monitorowano przez 2 min w spektrofotometrze Genesys 10 S UV-Vis (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). Aktywność enzymu obliczano stosując współczynnik ekstynkcji 0,00706 na mmol na mm, a jednostkę aktywności enzymu wyrażano jako mmol H2O2 rozłożony na minutę na mg białka. Następnie aktywność enzymu w traktowanych próbkach porównywano z kontrolą (100%).

GPx assay

Testowano zgodnie z opublikowaną procedurą64. Mieszanina reakcyjna (500 μl) zawierała 1 mM GSH, 0,15 mM NADPH, 0,12 jednostki reduktazy glutationowej (GR), 0,1 mM azydku sodu w 0,1 M fosforanie potasu (pH 7,0 z 1 mM EDTA. Azydek sodu dodawano do mieszaniny reakcyjnej w celu zahamowania aktywności endogennej katalazy. Mieszaninę reakcyjną inkubowano z 60 μg próbki przez 10 min bez NADPH, a reakcję rozpoczynano przez dodanie NADPH i H2O2 w końcowym stężeniu 150 μM. Szybkość zużycia NADPH monitorowano przy długości fali 340 nm przez 3 min. Jedną jednostkę aktywności GPx zdefiniowano jako ilość enzymu potrzebną do zużycia 1 μmol NADPH/min w teście sprzężonym, a aktywność wyrażono na mg białka. Następnie aktywność enzymatyczną traktowanych próbek porównywano z kontrolą (100%).

Analiza statystyczna

Wyniki eksperymentalne (n = liczba dołków połączonych z co najmniej dwóch różnych eksperymentów) przedstawiono jako średnią ± SEM. Wszystkie wykresy słupkowe zostały wykreślone przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism, wersja 3.00 (San Diego, CA). Dane analizowano pod kątem istotności za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie porównywano za pomocą testów wielokrotnego porównania Dunnetta lub Bonferroniego. Wartości testu P < 0,05 i P < 0,01 zostały uznane za znaczące i wysoce znaczące, odpowiednio.