Mechanisms of resistance to fluoroquinolones and carbapenems in Pseudomonas putida

Abstract

Objectives: Pseudomonas putida jest nieczęstym patogenem oportunistycznym, zwykle wrażliwym na środki przeciwdrobnoustrojowe. Dane dotyczące oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w klinicznych izolatach P. putida są ograniczone.

Pacjenci i metody: Wrażliwość na fluorochinolony, karbapenemy i inne antybiotyki scharakteryzowano w pięciu klinicznych izolatach P. putida odzyskanych od różnych pacjentów z zakażeniami dróg moczowych jako patogenami sprawczymi. Oporność na fluorochinolony i karbapenemy scharakteryzowano genetycznie za pomocą metod PCR i sekwencjonowania DNA. Profile białek błony zewnętrznej (OMP) scharakteryzowano metodą SDS-PAGE.

Wyniki: Cztery z pięciu izolatów były oporne lub pośrednie zarówno na fluorochinolony, jak i karbapenemy. Sekwencje nukleotydowe w regionach determinujących oporność na chinolony sugerowały, że mutacje aminokwasowe, takie jak Thr-83→Ile w GyrA i Glu-469→Asp w GyrB mogą przyczyniać się do wysokiej oporności na fluorochinolony. Cztery izolaty wytwarzające metalo-β-laktamazy, które wykazywały oporność na karbapenemy, były nosicielami genów metalo-β-laktamazy typu IMP. Połączony efekt zmniejszonej produkcji OMP o masie 46 kDa i produkcji metalo-β-laktamaz wykazał izolat P. putida wykazujący najwyższe MIC karbapenemów.

Wnioski: W niniejszym badaniu zidentyfikowano mechanizmy oporności na fluorochinolony i karbapenemy w klinicznych izolatach P. putida.

Wprowadzenie

Pseudomonas putida, niefermentująca pałeczka Gram-ujemna, jest oportunistycznym patogenem człowieka odpowiedzialnym za bakteriemię i posocznicę u noworodków, pacjentów z neutropenią i nowotworami, jak również za zakażenia dróg moczowych (UTI).1-4 Chociaż rzadko spotykana, P. putida może być przyczyną zakażeń szpitalnych u gospodarzy w trudnej sytuacji.3

Większość P. putida jest wrażliwa na środki przeciwbakteryjne, takie jak karbapenemy, fluorochinolony i aminoglikozydy.5-7 Jednakże, zgłoszono kliniczne izolaty P. putida, które wytwarzają metalo-β-laktamazy nadające oporność na β-laktamy, w tym karbapenemy.3,4,8,9 Ponadto, ostatnio zgłoszono izolaty wytwarzające metalo-β-laktamazy, które oprócz β-laktamów wykazywały oporność na ciprofloksacynę, gentamycynę i tobramycynę.3 Pojawienie się wielolekoopornych P. putida stało się przyczyną trudności w leczeniu zakażeń i stwarza ryzyko transmisji szpitalnej.

W kilku wcześniejszych badaniach oporność na antybiotyki u P. putida została scharakteryzowana w odniesieniu do produkcji metalo-β-laktamaz i charakterystyki systemów efflux.3,4,8-12 Zgodnie z doniesieniami z Europy, Korei i Japonii P. putida oporne na karbapenemy często wytwarzają metalo-β-laktamazy typu IMP- i VIM.3,4,8,9,9a Systemy effluksowe, takie jak TtgABC, MepABC, TtgDEF i ArpABC mogą również przyczyniać się do oporności wielolekowej u P. putida.10-12Pseudomonas aeruginosa ma zdolność do szybkiego uzyskiwania oporności w trakcie leczenia,13 chociaż nie jest jasne, czy P. putida ma taki sam potencjał. Aby ocenić ryzyko pojawienia się oporności na antybiotyki, potrzebne są obfite dane dotyczące oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w klinicznych izolatach P. putida. W tym badaniu określiliśmy wrażliwość na środki przeciwdrobnoustrojowe, w tym fluorochinolony i karbapenemy oraz scharakteryzowaliśmy mechanizmy oporności na fluorochinolony i karbapenemy w klinicznych izolatach P. putida odzyskanych jako patogeny wywołujące UTI w ciągu 1 roku w naszym szpitalu.

Pacjenci i metody

Pacjenci

Pięciu pacjentów (czterech mężczyzn i jedna kobieta), u których zdiagnozowano ostre, powtarzające się lub przewlekłe UTI wywołane przez P. putida w Szpitalu Uniwersyteckim Hamamatsu zostało włączonych do naszego badania od października 2001 do września 2002 roku.

Szczepy bakteryjne i metody mikrobiologiczne

Szczepy użyte w tym badaniu stanowiło pięć klinicznych izolatów P. putida odzyskanych od różnych pacjentów jako patogeny sprawcze. Identyfikację przeprowadzono za pomocą standardowych testów biochemicznych w naszym klinicznym laboratorium mikrobiologicznym. Wszystkie izolaty pochodziły z moczu. Wzory fragmentów chromosomalnego DNA ograniczone SpeI tych pięciu izolatów różniły się między sobą (Rycina 1). Bakterie przechowywano w temperaturze -70°C w bulionie do infuzji serca (Nissui Pharmaceutical, Tokio, Japonia) zawierającym 20% glicerolu. Następnie bakterie inokulowano na płytki agarowe z wywarem z serca (Nissui Pharmaceutical) i inkubowano w temperaturze 37°C przez noc. MIC oznaczano metodą rozcieńczeń agarowych, zgodnie z opisem Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), dawniej National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).14 Badanie wrażliwości przeprowadzono przy użyciu agaru Mueller-Hinton (Nippon Becton Dickinson, Tokio, Japonia) zgodnie z instrukcjami producenta. Kryteria interpretacyjne MIC dla ceftazydymu, imipenemu, meropenemu, norfloksacyny, lewofloksacyny, gatifloksacyny, gentamycyny, amikacyny i minocykliny były zgodne z kryteriami CLSI/NCCLS.14 Nie określono punktów krytycznych MIC dla innych środków przeciwdrobnoustrojowych.

Środki przeciwdrobnoustrojowe

Amplifikacja i sekwencjonowanie DNA regionów determinujących oporność na chinolony

Chromosomalne DNA wyodrębniono z izolatów P. putida zgodnie z wcześniejszym opisem.15 Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu określonych zestawów primerów. Zestaw primerów 5′-gacggcctgaagccggtgcac-3′ i 5′-gcccacgggcataccgctgga-3′ amplifikował 417 bp fragment regionów determinujących oporność na chinolony (QRDR) genu gyrA od pozycji 115 do 531.16 Zestaw primerów 5′-agtacttcgccgacttcct-3′ i 5′-tacaggcgcgacaggcgctt-3′ amplifikował fragment QRDR genu gyrB o długości 739 bp od pozycji 1073 do 1811.17 Zestaw primerów 5′-tctacgccatgagcgaactgg-3′ i 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ amplifikował 262 bp fragment QRDR genu parC od pozycji 158 do 419.18 Amplifikacje przeprowadzono przy użyciu enzymu Advantage-GC2 (BD Biosciences Clontech Japan, Tokio, Japonia) zgodnie z instrukcjami producenta. QRDRs sekwencjonowano przy użyciu zestawu BigDye terminator v3.0 Taq cycle sequencing ready reaction kit z polimerazą AmpliTaq DNA (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) i zautomatyzowanego systemu sekwencjonowania DNA (analizator genetyczny ABI PRISM 310, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Genetyczna detekcja genów metalo-β-laktamaz

Przygotowanie białek błony zewnętrznej

Białka błony zewnętrznej (OMP) przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem.21. Próbki analizowano metodą SDS-PAGE.

Wyniki

Wrażliwość

Wyniki badań wrażliwości na fluorochinolony i karbapenemy zestawiono odpowiednio w Tabelach 1 i 2. MIC β-laktamów wynosiły od >128 mg/L dla ampicyliny i cefalorydyny, 2 do >128 mg/L dla ceftazydymu, 1 do 128 mg/L dla imipenemu, 0,5 do >128 mg/L dla panipenemu, 4 do >128 mg/L dla meropenemu i 1 do >128 mg/L dla biapenemu. Zakresy MIC aminoglikozydów i minocykliny były następujące: 0,25 do 8 mg/L dla gentamycyny, 0,5 do 8 mg/L dla amikacyny, 0,5 do 1 mg/L dla kanamycyny i 4 do 64 mg/L dla minocykliny. Cztery izolaty były oporne lub pośrednie zarówno na fluorochinolony, jak i karbapenemy, podczas gdy jeden izolat, HU2001-429, był wrażliwy zarówno na β-laktamy, jak i fluorochinolony. Trzy izolaty P. putida, HU2001-412, HU2001-419 i HU2001-451, wykazywały oporność na wszystkie badane β-laktamy, takie jak ceftazydym, imipenem i meropenem. Trzy izolaty, HU2001-412, HU2001-419 i HU2002-467, wykazywały wysoką oporność na fluorochinolony (>128 mg/L), w tym norfloksacynę, lewofloksacynę, sparfloksacynę, gatifloksacynę i pazufloksacynę, a także oporność na minocyklinę (32 do 64 mg/L). U pięciu izolatów zakres MIC dla sitafloksacyny wynosił od ≤0,125 do 8 mg/L.

Oporność na fluorochinolony

Oporność na karbapenemy

Spośród pięciu izolatów P. putida, cztery wykazujące oporność na karbapenemy były nosicielami genu metalo-β-laktamazy typu IMP, natomiast geny metalo-β-laktamazy typu VIM nie zostały wykryte metodą PCR (Tabela 2). Zakresy MIC karbapenemów u P. putida niosącego geny metalo-β-laktamazy typu IMP były następujące: 8 do 128 mg/L dla imipenemu, 32 do >128 mg/L dla panipenemu, 128 mg/L lub więcej dla meropenemu i 32 do >128 mg/L dla biapenemu. U P. putida HU2001-451, który wykazywał najwyższe MIC karbapenemów spośród pięciu izolatów, produkcja OMP o masie 46 kDa była niewykrywalna metodą SDS-PAGE, podczas gdy u P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 i HU2002-467 była wykrywana podobnie (tab. 2).

Dyskusja

W tym badaniu scharakteryzowaliśmy wrażliwość na fluorochinolony i karbapenemy w pięciu klinicznych izolatach P. putida wyizolowanych od różnych pacjentów z ostrymi, powtarzającymi się lub przewlekłymi UTI. Wszystkie pięć izolatów wykazywało różne genotypy PFGE, co sugeruje, że żadna z infekcji wywołanych przez te P. putida nie była zakażeniem szpitalnym. Cztery z pięciu izolatów były oporne lub średnio oporne zarówno na fluorochinolony, jak i karbapenemy. Trzy izolaty wykazywały wysoką oporność (>128 mg/L) na wszystkie badane fluorochinolony z wyjątkiem sitafloksacyny. Spośród fluorochinolonów badanych w tym badaniu, sitafloksacyna wykazała wyższą siłę działania wobec izolatów P. putida. Izolaty te, wysoce oporne na fluorochinolony, były również oporne na karbapenemy i minocyklinę. Wszystkie izolaty były wrażliwe na aminoglikozydy, takie jak amikacyna.

Badania nad opornością na fluorochinolony u P. putida są ograniczone.6,12 U P. aeruginosa główne mechanizmy odpowiedzialne za oporność na fluorochinolony obejmują mutacje aminokwasowe w gyrazie DNA lub topoizomerazie IV spowodowane mutacjami w QRDR GyrA i ParC, podczas gdy niektóre doniesienia sugerują udział mutacji GyrB w oporności na fluorochinolony.18,22 Wtórny mechanizm oporności u P. aeruginosa, który obejmuje systemy efflux, przyczynia się do zmniejszonej wrażliwości na fluorochinolony.22,23 W tym badaniu porównano zmiany aminokwasów w QRDR GyrA, GyrB i ParC w pięciu klinicznych izolatach P. putida. Oporne na fluorochinolony P. putida miały dodatkowe mutacje, takie jak Thr-83→Ile w GyrA i Glu-469→Asp w GyrB, które odpowiadały mutacjom stwierdzonym u opornych na fluorochinolony P. aeruginosa.22,23 Wyniki te wskazują, że mutacje aminokwasowe w QRDR, takie jak Thr-83→Ile w GyrA i Glu-469→Asp w GyrB mogą przyczyniać się do wysokiej oporności na fluorochinolony, chociaż nie ustalono, czy transformacja plazmidami niosącymi geny gyrA, gyrB lub parC typu dzikiego do takich izolatów obniży MIC fluorochinolonów.24 Zakres MIC sitafloksacyny wynosił od ≤0,125 do 8 mg/L dla pięciu izolatów P. putida. Chociaż wcześniejsze doniesienia wykazały, że nadekspresja systemów efflux TtgABC, MepABC, TtgDEF i ArpABC może również przyczyniać się do oporności wielolekowej u P. putida,10,11,12 rola systemów efflux pozostała niejasna w tym badaniu.

Oporność na karbapenemy u P. putida spowodowana wytwarzaniem metalo-β-laktamaz została zgłoszona.3,4,8,9,9a Te metalo-β-laktamazy wykryte u P. putida obejmowały typy IMP- i VIM.3,4,8,9,9a U czterech opornych na karbapenemy P. putida wykryto produkcję metalo-β-laktamaz metodą dyfuzyjno-krążkową (dane nie pokazane). Izolaty te były nosicielami genów metalo-β-laktamaz typu IMP, podczas gdy geny metalo-β-laktamaz typu VIM nie zostały wykryte metodą PCR. Występowanie P. putida wytwarzającego metalo-β-laktamazy jest ważnym problemem klinicznym, stanowiącym rezerwuar genetycznych determinantów oporności na β-laktamy. U P. aeruginosa inne główne mechanizmy oporności na karbapenemy obejmują mutacyjną nieprzepuszczalność wynikającą z utraty OprD – porinotwórczego kanału transmembranowego dostępnego dla karbapenemów, ale nie dla innych β-laktamów – oraz wytwarzanie metalo-β-laktamaz.21,25,26 Utrata OprD skutkuje opornością na imipenem i zmniejszoną wrażliwością na meropenem u P. aeruginosa.27 U P. putida HU2001-451, wykazującego najwyższe MIC (≥128 mg/L) wszystkich karbapenemów spośród czterech izolatów opornych na karbapenemy, produkcja OMP o masie 46 kDa była zmniejszona w porównaniu z innymi izolatami. Profile OMP u P. putida HU2001-451 były podobne do tych u opornej na karbapenemy P. aeruginosa, u której w naszym poprzednim badaniu zidentyfikowano zmniejszoną produkcję OprD.21 Wyniki te wykazały łączny wpływ zmniejszonej produkcji 46 kDa OMP współistniejącej z produkcją metalo-β-laktamaz na oporność na karbapenem w izolacie, chociaż to, czy inne β-laktamazy miały znaczenie dla oporności na karbapenem, było niejasne.

Podsumowując, scharakteryzowaliśmy oporność na fluorochinolony i karbapenemy w klinicznych izolatach P. putida. Nasze wyniki wskazują, że mutacje aminokwasowe w QRDR, takie jak Thr-83→Ile w GyrA i Glu-469→Asp w GyrB, mogą przyczyniać się do wysokiej oporności na fluorochinolony u P. putida. Cztery izolaty P. putida wytwarzające metalo-β-laktamazy, które wykazywały oporność na karbapenemy, były nosicielami genu metalo-β-laktamazy typu IMP. Znaleźliśmy połączony efekt zmniejszonej produkcji 46 kDa OMP i produkcji metalo-β-laktamaz, które wzmocniły oporność na karbapenemy w izolacie P. putida wykazującym najwyższe MIC karbapenemów.

Dziękujemy Miroku Medical Laboratory, Saku, Nagano, Japonia, za analizę PFGE. T. H. jest wspierany przez Grant-in-Aid for Scientific Research (17790353) od Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

Uwagi autorów

1Department of Laboratory Medicine, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 2Group of Infection Control Research, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 3Division of Pharmacy, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 4Department of Clinical Laboratory Medicine, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 54 Shogoin-Kawahara-cho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8507, Japan

.